تست حساسيت ميكروبی

آزمايش های تست حساسيت  ميكروبی ميتواند برای پيداكردن داروی موثر، اپيدميولوژی و پيش بينی نتيجه بعد از درمان بيماری مورد استفاده قرار گيرد. در اين مطالعه ما روی روشهای آزمايشگاهی آنتی ميكروبی در آزمايشگاه برای بررسی كشف و استخراج خاصيت ضد ميكروبی داروها بر روی عوامل بيماری زا ميپردازيم.

معروف ترين و اساسی ترين روشها انتشار ديسک، محيط مايع و رقيق كردن در محيط آگار هستند. روشهای ديگر اختصاصی برای آزمايشهای ضدقارچ، استفاده از تكنيک مواد غذايی سمی ميباشد. برای مطالعه تاثير ضد ميكروبی با توجه به جذابيتهای جديد خواص محصولات ضد ميكروبی جديد مانند مبارزه با باكتريهای مقاوم به چند دارو، بسيار مهم است كه به منظور گسترش يک درک بهتر از روشهای فعلی موجود برای غربالگری و يا كميت اثر ضد ميكروبی عصاره يا يک تركيب خالص برای آن برنامه های كاربردی در سلامت انسان، كشاورزی و محيط زيست داشته باشيم.

روش های انتشار :

1- روش انتشار ديسک در آگار (diffusion-disk Agar)

اين روش در سال 1940 گسترش يافت و يک روش معمول مورد استفاده در بسياری از آزمايشگاههای ميكروبشناسی بالينی برای تست حساسيت  ميكروبی ميباشد. امروزه، بسياری از استانداردهای پذيرفته شده و تاييد شده توسط موسسه استاندارد باليني و CLSI  برای باكتريها و مخمرهای مورد بررسی منتشر شده است. با وجود اين كه همه باكتريهای مشكل پسند را نميتوان به طور دقيق با اين روش آزمايش كرد، استاندارد سازی اين گونه باكتريها مثل استرپتوكوک، هموفيلوس آنفلوآنزا، هموفيلوس پاراآنفلوآنزا، نايسريا گونوره و نايسريا مننژيتيديس با استفاده از محيطهای كشت مخصوص، شرايط مختلف انكوباسيون و معيارهای تفسيری برای ناحيه های مهار رشد انجام شده است. در روش انتشار ديسک در آگار، پليت آگار با مقدار استانداردی از ميكروارگانيسم مورد آزمايش تلقيح ميشود سپس، ديسک‌های كاغذ فيلتر (حدود 6 ميلي متر در قطر) حاوی تركيب تست در غلظت مورد نظر بر روی سطح آگار قرار داده ميشود. پتری ديش تحت شرايط مناسب انكوبه ميشود.

معمولا عامل ضد ميكروبی در آگار پخش شده و مانع جوانه زنی و رشد ميكروارگانيسم مورد آزمايش شده و پس از آن قطر ناحيه مهاركننده رشد اندازه گيری ميشوند. آنتی بيوگرام بر اساس نتايج كيفی باكتريها را به گروه حساس، نيمه حساس و يا مقاوم طبقه بندی می كند. بنابراين، اين روش به عنوان يک ابزار پايه ای برای تعيين نوع فنوتيپ مقاومت در بين باكتريهای آزمايش شده ميباشد و نتايج آن نيز ميتواند به پزشكان در انتخاب درمان تجربی اوليه مناسب و نوع آنتی بيوتيک استفاده شده برای هر بيمار در شرايط خاص كمک نمايد. با اين حال، از آنجا كه مهار رشد باكتری به معنی مرگ باكتری نيست لذا اين روش نميتواند تاثيرات bactericidal كشتن باكتری و bacteriostatic(متوقف كننده رشد باكتری) يک دارو را از هم تشخيص دهد.

روش ديسک ديفيوژن مزايای بسياری نسبت به روشهای ديگر دارد: سادگی، كم هزينه بودن، توانايی تست تعداد زيادی از ميكروارگانيسمها و عوامل ضد ميكروبی و سهولت بری تفسير نتايج. عالوه بر اين، چندين مطالعه رضايت بيمارانی كه دارای عفونت باكتريايی بوده اند و از درمان ضدباكتريايی خود از روشهای بر پايه آنتی بيوگرام برای تشخيص و درمان استفاده كرده اند را نشان ميدهد.

2- روش MIC و MBC

روش MIC: به كمترين مقدار از آنتی بيوتيک اتلاق می شود كه می تواند به طور قابل توجهی رشد يک ارگانيسم را پس از گذشت يک دوره انكوباسيون مشخص (16 تا 20 ساعت  بسته به گونه باكتری ) مهار نمايد.

روش MBC: به كمترين غلظت از آنتی بيوتيک اطلاق ميشود كه می تواند پس از گذشت 24 ساعت جمعيت باكتريايی را به ميزان 99 ٪ كاهش دهد به عبارت ديگر ، جمعيت اوليه را هزار بار كاهش دهد.

در عمل ، تجويز يک آنتی بيوتيک هيچگاه به طور كامل موجب نابودی جمعيت باكتری ها نمی شود ، بلكه صرفا يا رشد باكتری متوقف می شود (خاصيت متوقف كنندگی رشد ) و يا تعداد آنها به حداقل كاهش می يابد (تاثير باكتری كشی ) .در نهايت همواره اين دستگاه ايمنی است كه نابود سازی جمعيت باكتری ها را بر عهده دارد.

در MIC 50 : حداقل غلظت آنتی بيوتيكی كه ميتواند 50% از تمامی سويه های باكتريايی تحت آزمايش را مهار نمايد.

در MBC 90 : حداقل غلظت آنتی بيوتيک كه ميتواند 90% از تمامی سويه های باكتريايی تحت آزمايش را مهار نمايد.

3- روش رقيق كردن در محيط مايع Broth dilution

رقت به صورت Micro يا Macro در محيط مايع يكی از اساسی ترين روشهای آزمايش حساسيت مواد ضد ميكروبی است. اين پروژه مستلزم آماده كردن 2 تارقت از يک ماده ضدميكروبی به عنوان مثال 1،2،4،8،16و32 ميكروگرم بر ميلی ليتر در يک محيط كشت مايع است كه به لوله های حاوی حداقل حجم 2 ميلی ليتر توزيع ميشود كه اين روش Macrodilution ناميده ميشود و در Microdilution از لوله های با حجم كمتر مانند پليت ميكروتيتراسيون دارای 96 خانهای استفاده ميشود. سپس هر لوله را با حجم مناسبی از تلقيح ميكروبی آماده شده در همان محيط بعد از رقيق كردن سوسپانسيون ميكروبی استاندارد شده تلقيح می‌كنند تا كدورت معادل 5.0 در مقياس مک فارلند به دست آيد. پس از اين كه به خوبی مخلوط شدند لوله های تلقيح شده يا پليت 96 خانهای را انكوبه كرده اغلب بدون تكان دادن و تحت شرايط مناسب بسته به ميكروارگانيسم مورد آزمايش كه انكوبه شده است قرار ميدهند. روش تجربی با انجام دقيق Microdilution در شكل  نشان داده شده است.

برخلاف روش Microdilution ،از معايب اصلی روش Macrodilution خسته كننده بودن، نداشتن كتابچه راهنمای كاربر، خطر به وجود آمدن خطا در آماده سازی روشهای ضد ميكروبی برای هر آزمايش و مقدار نسبتا زيادی از معرف و فضای مورد نياز ميباشد. بنابراين تكرار پذيری و مقرون به صرفه بودن و فضايی كه با توجه به كوچک سازی آزمون رخ ميدهد مزيتهای عمدهای از روش Microdilution به شمار ميروند.