منابع ایجاد خطا در الایزا

منابع ایجاد خطا در الایزا

۱- عدم رعایت روش ذکرشده در بروشور (کمپانی سازنده ممکن است بدون اطلاع قبلی روش کار خود را عوض کند).

۲- باز کردن فویل حاوی پلیت (بلافاصله بعد از آنکه از یخچال خارج شد): پلیت سرد، بخار آب موجود در هوا را به قطرات کوچکی تبدیل می‌کند که روی جدارهای چاهک‌ها خواهد نشست. این عمل سبب می‌شود که در برخی تست‌ها که حجم نمونه کم است (مثلاً ۱۰ میکرولیتر) نمونه رقیق شود. در هنگام باز کردن فویل حاوی پلیت به کپسول نم‌گیر موجود در آن دقت شود. اگر پوشش فوق سوراخ باشد کپسول نم‌گیر تغییر رنگ می‌دهد و یا سیلیکاژل موجود در آن به هم می‌چسبد.

۳- اثر همولیز بر روی نتایج: هموگلوبین به دلیل ماهیت پروتئینی، فعالیت پراکسیدازی داشته و همچنین به دلیل وجود آهن و هم می‌تواند سرعت واکنش پراکسید هیدروژن و کروموژن را تسریع کرده و به‌طور کاذب باعث افزایش جذب نوری شود. از طرفی هموگلوبین واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را دستخوش تغییر می‌کند و زمان به تعادل رسیدن واکنش را افزایش می‌دهد (مثل Free T۴ که به‌طور کاذب کاهش می‌یابد).

۴- تأثیر ضد انعقاد استفاده‌شده: ضد انعقاد EDTA به‌عنوان شلاته‌کننده یون‌های فلزی می‌تواند روی (ZN) که به‌عنوان کوفاکتور آنزیم آلکالین فسفاتاز است را مهار ‌کند. فلوئور سدیم که به‌عنوان نگهدارنده قند استفاده می‌شود می‌تواند فعالیت آنزیم اوره‌آز را مهار ‌کند، بنابراین در سنجش‌هایی که از آنزیم اوره‌آز به‌عنوان ماده نشانگر استفاده شده است، تداخل می‌کند .

سدیم آزاید به‌عنوان یک مهارکننده قوی آنزیم پراکسیداز است و هرگز نباید در سنجش‌هایی که نشانگر آنزیمی آنها پراکسیداز است از نمونه حاوی سدیم آزاید استفاده شود .

۵- پلیت‌ها در هنگام رنگ‌زایی باید در دمای ۲۵-۱۸ درجه سانتیگراد قرار گرفته و در معرض باد سرد و گرم نباشند چرا که دمای محیط می‌تواند سرعت واکنش رنگ‌زایی را تغییر داده و در نتیجه منجر به رنگ‌زایی کم یا زیاد شده و با بی‌اعتبار کردن کنترل مثبت و منفی کل کار انجام شده را بی‌اعتبار (invalid) کند .

۶- خطا در زمان انکوباسیون (خطای زمانی در انکوباسیون‌های کوتاه‌مدت بیشتر است). در مرحله انکوباسیون و در اثر آنزیم به یک محصول رنگی – تبدیل می‌شود- به‌هیچ‌وجه از فویل آلومینیومی برای پوشاندن سطح پلیت استفاده نشود.

مشکلات مرتبط به شستشو:

عمل شستشو جهت جدا کردن ترکیبات اتصال‌یافته به کف چاهک از ترکیباتی که متصل نشده‌اند صورت می‌گیرد. غیر از ترکیبات محلول شستشو، نکات دیگری نیز باید مدنظر قرار گیرد.

فشار بالای شستشو در روش دستی ناشی از تخلیه سریع بافر است که منجر به جدا‌سازی و حذف اتصالات اختصاصی از کف چاهک‌ها و کاهش کاذب (OD) می‌گردد.

فشار پایین شستشو به علت تخلیه آهسته بافر در روش‌های دستی منجر به عدم دفع کامل اتصالات غیراختصاصی و افزایش کاذب جذب نوری (OD) می‌گردد .

مشکلات مربوط به شستشو به‌سختی قابل تشخیص بوده و به‌صورت اتفاقی با خوانده‌هایی که خیلی بالا و یا پایین باشد مشخص می‌شوند. رفع این مشکل کالیبره کردن مجدد دستگاه شوینده است. محلول شستشو معمولاً غلیظ‌تر بوده و باید در آزمایشگاه رقیق شود. اگر رقت درست صورت نگیرد و محلول غلیظ‌تر از حد توصیه‌شده باشد، منجر به تخریب و جدا شدن مولکول‌های اتصال‌یافته می‌شود و برعکس کاهش توانایی محلول شستشو بدلیل رقیق‌سازی زیاد باعث عدم جدا شدن اتصالات غیراختصاصی و ایجاد جذب زمینه‌ای بالا می‌شود. مرحله شستشو حداقل باید سه بار انجام شود و محلول اضافی باید تخلیه شده و یا آسپیره گردد. در نهایت باید محلول اضافه داخل چاهک با کوبیدن بر سطح یک کاغذ یا دستمال نم‌گیر خالی شود (دستورالعمل کنترل کیفی آزمایشگاه رفرانس قم).

۷- Soak time: رعایت زمان خیس خوردن سبب می‌شود که اتصالات غیراختصاصی از چاهک‌ها کنده شود. عدم رعایت این موضوع موجب ایجاد یک رنگ زمینه در کل چاهک‌های پلیت کاری خواهد شد و اگر تست فاقد چاهک بلانک باشد این موضوع منجر به ایجاد جواب‌های کاذب می‌شود. این زمان در بروشور کیت آمده است و بین ۳۰ ثانیه تا چند دقیقه متغیر است.

۸- لیپمی در سنجش آنالیت‌هایی که یک مولکول آب‌گریز است بدلیل آنکه توزیع آنالیت بین دو فاز آب‌گریز و آب‌دوست به دلیل وجود لیپید مختل می‌شود و همین‌طور در بعضی از آنالیت‌ها که به پروتئین حامل متصل می‌شود وجود اسید چرب آزاد ممکن است در اتصال آنالیت به پروتئین حامل تداخل نماید و سبب افزایش کاذب میزان آنالیت آزاد می‌شود (به‌خصوص هورمون‌های تیروئیدی و استروئیدی)، بنابراین ناشتا بودن در این آزمایش‌ها ضروری است.

۹- تماس دﺳﺖ ﺑﺎ ﻧﻮک ﺳﻤﭙﻠﺮ و آلودگی ﺑﺎﮐﺘﺮﯾﺎل آن می‌تواند ﻣﻨﺠﺮ ﺑﻪ آلودگی ﻣﺤﻠﻮل کنژوگه و ﺗﻀﻌﯿﻒ ﯾﺎ ﺧﻨﺜﯽ ﺷﺪن ﻣﻌﺮف کنژوگه ﮔﺮدد. اﺳﺘﺎفیلوکوک‌ها و اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﮐﻮک‌ها به‌واسطه رﺳﭙﺘﻮر FC ﻗﺎدر ﺑﻪ ﺟﺬب غیراختصاصی اﯾﻤﻮﻧﻮﮔﻠﻮﺑﯿﻦ G در ﻣﺤﯿﻂ ﺑﻮده و ﻣﻨﺠﺮ ﺑﻪ ﺟﺬب آﻧﺘﯽ‌ﺑﺎدی کنژوگه و ﺗﻀﻌﯿﻒ ﺗﯿﺘﺮ کنژوگه می‌گردند.

۱۰- اثر حاشیه‌ای(Edge effect)انکوباتور ۳۷ درجه ‌سانتی‌گراد به‌واسطه شوک حرارتی و اختلاف حرارت محیط کار و محیط داخلی انکوباتور حاصل می‌گردد و عمدتاً در سطح استریپ‌هایی که مجاور درب خارجی انکوباتور قرار دارند ایجاد می‌شود و جذب نوری (OD) غیریکنواخت خصوصاً در استریپ‌های ابتدایی حاصل می‌شود. این امر به‌واسطه ورود ناگهانی سرمای محیط به داخل انکوباتور است، لذا از انکوباسیون پلیت‌های الایزا در مکان‌هایی که شرایط محیطی متغیر دارند، پرهیز گردد.