قبلا در مقاله های “جداسازی و خالص سازی اسید نوکلئیک” ، “استخراج RNA با ترایزول (TRIzol)” ، “استخراج پلاسمید” ، “استخراج DNA از خون کامل” و “استخراج پروتئین های پریپلاسمی” به برسی و شرح کامل پروتکل ها و نحوه استخراج اسید نوکلئیک پرداختیم.
اکنون میخواهیم بدانیم اساس عملکرد کیتهای استخراج RNA – DNA چیست، از چه محلول هایی ساخته شده اند و چگونه توانایی متلاشی کردن غشا، دیواره سلولی و تفکیک اسید نوکلئیک را از دیگر اجزا سلولی دارند.
اکنون به شرح وظایف و عملکرد هر یک از بافر ها و محلول های فوق در طی پروسه استخراج اسید نوکلئیک میپردازیم.
از لایزیز بافر برای تخریب غشا سلولی و غشا هسته ایی استفاده میشود. بافر لیز کننده از Tris, EDTA, MgCl2, KCl, NaCl و SDS ساخته شده است. همچنین بافر لیز کننده میتواند برای از بین بردن پروتئین های متصل به اسید نوکلئیک مفید واقع شود.
نقش MgCl2 در بافر لیز کننده محافظت از DNA بعد از تخریب غشا هسته میباشد. آنزیم های DNase بعد از تخریب غشا هسته به اسید نوکلئیک دسترسی می یابند، از این رو اضافه نمودن MgCl2 اهمیت دارد.
ماده MgCl2 با مسدود کردن بار منفی لیپوپروتئین ها از DNA محافظت می کند و نمک هایی مانند NaCl و KCl بارهای DNA را خنثی می کنند و به خروج DNA کمک می کند.
خرید انواع بافر لیز کننده سلولی
سدیم دودسیل سولفات (SDS) یک شوینده آنیونی است که ساختار پروتئینی ثانویه و هر ساختار ثالث پروتئینی غیر سولفیدی را دناتوره میکند. SDS برای هر پروتئین به اندازه آنها بار منفی ایجاد می کند. در حقیقت SDS پروتئین های غشایی و متصل به DNA را حل و تخریب مینماید.
ماده EDTA به عنوان یک عامل شلات کننده(Chelating) در استخراج DNA عمل می کند. یون فلزی موجود در آنزیم ها را کلات می کند و همانطور که همه می دانیم یونهای فلزی فعالیت آنزیم را افزایش می دهد. با کلاته کردن یونهای فلزی، آنزیمها را غیرفعال می کند، بنابراین فعالیت DNase و RNase را کاهش می دهد.
پروتئیناز K در طول استخراج DNA برای هضم بسیاری از پروتئین های آلوده کننده موجود در نمونه استفاده می شود. همچنین نوکلئازهایی را که ممکن است در استخراج DNA وجود داشته باشد تجزیه می کند و از اسید نوکلئیک در برابر حمله نوکلئاز محافظت می کند.
بافرهای شستشو به طور کلی حاوی الکل هستند و می توان از آنها برای حذف پروتئین ها، نمک ها و سایر آلاینده ها از نمونه یا شستشو بافر های قبلی استفاده کرد.
دو نوع بافر در طی فرایند استخراج استفاده میشود، که تفاوت آنها در قدرت یونی و درصد الکل انهاست. در طی عمل استخراج از الکل مطلق و الکل 70% استفاده میشود. این امر سبب افزایش خلوص DNA و جلوگیری از بین رفتن اسید نوکلئیک میشود.
به طور معمول، بافر لیز کننده/اتصال (lysis/binding) حاوی یک نمک چائوتروپیک (به عنوان مثال، ایزوتیوسیانات گوانیدینیوم) است در حالی که بافر شستشو حاوی غلظت بالایی از اتانول (یا ایزوپروپانول) است. هرگونه انتقال این بافرهای استخراج (بافر لیز کننده یا بافر شستشو) به بافر رها ساز (Elution Buffer) می تواند تا حد زیادی مانع از تجزیه و تحلیل صحیح در مراحل بعد میشود.
محلول Buffer RW1 حاوی نمک گوانیدین و همچنین اتانول است و به عنوان یک بافر شستشو قوی استفاده می شود که مولکول های زیستی مانند کربوهیدرات ها، پروتئین ها، اسیدهای چرب و غیره را که به طور خاص به غشای سیلیکونی متصل نیستند، را حذف می کند.
با توجه به مراحل شستشو، معمولاً از محلول اتانول 70 استفاده می شود. این امر باعث حل شدن نمک ها و در عین حال حلالیت DNA را به حداقل می رساند. بنابراین نمک ها به دلیل تفاوت حلالیت، حذف می شوند.
همان طور که از اسم این بافر پیداست کار این بافر ایجاد شرایطی برای اتصال DNA به سطح غشای ستون سیلیس میباشد. نکته قابل توجه در این بافر عدم وجود یک فرمول ثابت برای تمام اتصالات DNA به غشا سیلیکایی است. به این معنا که در PH ها و کیت های مختلف فرمول این بافر نیز برحسب نیاز دچار تغییرات کوچکی میشود.
اما می توان به طور کلی گفت مواد تشکیل دهنده بافر اتصال شامل NaCl یا MgCl2 ،EDTA ،DTT ،Heps ،tris ،KCl گاهی EGTA برای اتصال پروتئین خاصی به DNA نیز مهم است و oligo dT DNA، اسپرم ماهی قزل آلا و BSA را می توان برای از بین بردن اتصال غیر اختصاصی استفاده کرد.
در مرحله ی دوم می بایست ماکرومولکول مدنظر (که در اینجا DNA و یا پلاسمید می باشد) در نهایت با اضافه کردن بافر و تغییر خاصیت یونی، از ستون جدا سازی شده و در کالکشن تیوب جمع آوری گردد.
در بخش دوم مقاله با نحوه عملکرد بافر های TE، TRIS، TRIS-HCL، B1،Neutralization و محلول های سدیم کلرید، اتانول،RNA حامل، ترایتون X100 آشنا میشویم.
نقش اصلی آن حفظ pH در یک نقطه پایدار، معمولاً 8.0 است. علاوه بر این، تریس به احتمال زیاد با LPS (لیپو پلی ساکارید) موجود در غشا واکنش داده و باعث ایجاد بی ثباتی در غشا می شود.
بافر تریس از تریس (هیدروکسی متیل) آمینومتان ساخته شده است و یک ترکیب شیمیایی ایزوتونیک و غیر سمی است. همچنین به نام ترومتامین یا THAM نیز شناخته می شود.
پاسخ سریع این است که tris یک بافر پایه بوده، در حالی که tris HCl بافر اسیدی است. به خاطر داشته باشید، از بافرها برای مقاومت در برابر تغییرات pH استفاده می شود. حتی غلظت های کم یک اسید یا باز قوی، بدون بافر، می تواند pH محیط را به میزان قابل توجهی تغییر دهد.
همانطور که میدانید تمام بافر ها به تغییرات دمایی حساس بوده و مقدار مقاومت در برابر تغییرات pH آنها را دستخوش تغییراتی میکند. Tris یک مثال هشداردهنده از این موضوع میباشد، زیرا تغییر زیادی در مقدار مقاومت در برابر تغییرات pH با تغییر دما نشان می دهد.
خرید انواع بافر تریس و تریس HCl
یونهای Na+ با فسفات مولکول DNA پیوند یونی تشکیل می دهند و بار منفی را خنثی می کنند و اجازه می دهد مولکول های DNA در کنار هم مجتمع شوند.
خرید سدیم کلراید در گرید های مختلف
نقش اصلی کاتیونهای تک ظرفیتی و اتانول خارج کردن آب از هسته (ازبین بردن آبپوشی DNA) میباشد، بنابراین DNA بعد از خشک شدن الکل رسوب میکند. اتانول به آب ترجیح داده می شود زیرا ثابت دی الکتریک آن کمتر است.
تریتون X-100 (TX100) یکی از پرکاربردترین سورفکتانت های غیر یونی برای لیز کردن سلولها میباشد.این ماده چربی زدای قوی است و سبب استخراج پروتئین و سایر اندامک های سلولی نیز میشود. همچنین باعث بالا بردن نفوذ پذیری غشا سلول زنده جهت رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس میشود.
بافر TE یک بافر متداول در زیست شناسی مولکولی است، به ویژه در روش های استخراج اسید نوکلئیک که شامل DNA،cDNA یا RNA است، استفاده میشود. “TE” از ،Tris، یک بافر pH معمولی، و EDTA، یک مولکول که کاتیون هایی مانند Mg2+ را کلات می کند، تشکیل شده است. بافر TE همچنین بافر T10E1 نامیده می شود و “بافر تی 10 ای 1” خوانده می شود.
بافر DNA ،TE یا RNA را حل کرده و از اسید نوکلئیک در برابر تجزیه توسط DNase یا RNase محافظت می کند. همچنین به لیز دیواره سلولی و غشای هسته ای کمک می کند. در واقع بافر TE یک نگهدارنده DNA است که DNA را به مدت طولانی و بدون تجزیه در خود نگه میدارد.
ویژگی محافظت کننده بافر TE از اسید نوکلئیک، از محلول EDTA نشات میگیرد، که در قست توضیحات این محلول عملکرد آن را شرح دادیم.
ویروسها اغلب دارای کپسید پروتئینی هستند که مواد ژنتیکی آنها را پوشش می دهد. پروتئیناز K کپسید را هضم می کند.
مولکول RNA حامل Poly (A) RNA است که برای بالا بردن مقدار DNA/RNA استخراج شده از نمونه ها استفاده میشود. به ویژه هنگامی که از نمونه هایی با غلظت کم DNA/RNA استفاده میکنیم.
هنگام تخلیص مقادیر کم DNA با استفاده از روش ستون سیلیکون، افزودن RNA یا DNA حامل، ریکاوری اسید نوکلئیک را افزایش می دهد.
هنگام استفاده از نمونه حاوی مقدار اضافی DNA مانند مدفوع، سلول های خونی و سایر موارد، RNA حامل مورد نیاز نیست.
لطفاً توجه داشته باشید که برخی از کیت های استخراج از قبل حاوی RNA حامل (مکمل بافر لیز کننده) است. در این موارد، پلی (A) اضافی مورد نیاز نیست.
بافر B1 در ترکیب با لیزوزیم یا لیزواستافین و پروتئیناز K برای تجزیه موثر باکتریها قبل از تصفیه DNA استفاده می شود. لطفاً توجه داشته باشید که این بافر برای هرگونه روش تصفیه با استفاده از ستون های چرخشی مبتنی بر غشای سیلیس توصیه نمی شود.
بافر B1 (بافر لیز کننده باکتریایی 1) شامل Tris • Cl pH 8.0 ،EDTA pH 8.0 و Triton-X100 میباشد.
خرید انواع کیت های استخراج پلاسمید
بافر خنثی سازی (3.0 M استات پتاسیم ، pH 5.0) لیزات حاصله را خنثی کرده و شرایط مناسبی را برای اتصال DNA پلاسمید به ستون غشای سیلیکونی ایجاد می کند. پروتئینها، DNA غیر پلاسمیدی و بقایای سلولی با یک مرحله سانتریفوژ رسوب کرده و مایع رویی روی یک ستون بارگذاری می شود.
تفاوتی ندارد با یک سلول یوکاریوتی گیاهی و جانوری کار می کنید و یا یک سلول پروکاریوتی در هر صورت باید ساختار منظم سلولی متلاشی گردد تا ژنوم سلول مدنظر استخراج شود. جهت متلاشی کردن سلول ها از سه روش فیزیکی، شیمیایی و آنزیمی استفاده می گردد که در مقاله “اساس عملکرد کیتهای استخراج RNA – DNA” با کاربرد برخی از مواد شیمیایی و بافر ها در متلاشی کردن ساختار سلولی آشنا شدید.
Written by: AliReza iraji
