هر پروتئین یا پپتید از یک توالی خطی از اسیدهای آمینه تشکیل شده است. ساختار اولیه پروتئین به طور متعارف از انتهای آمینو ترمینال (N) آغاز می شود و تا پایان تركیبات كربوكسیل (C) ادامه می یابد. ساختار یک پروتئین ممکن است به طور مستقیم از توالی DNA توالی یا استنباط شود.
توالی اسید آمینه یک پودر پروتئین پگاه یا پپتید اطلاعات مفیدی برای درک پروتئین یا پپتید ، شناسایی آن در یک نمونه و دسته بندی تغییرات پس از ترجمه آن است. روند تعیین توالی اسید آمینه به عنوان توالی پروتئین شناخته می شود.
توالی یک پروتئین با توجه به ترتیب اسیدهای آمینه از ترمینال آمینو به تركیبات كربوكسیل پروتئین معمولاً به عنوان یك رشته حروف یادداشت می شود. برای نشان دادن هر اسید آمینه در توالی ممکن است از یک کد تک یا سه حرفی استفاده شود.
20 اسید آمینه وجود دارد که به طور طبیعی در طبیعت وجود دارد ، که می تواند با یک کد سه حرفی یا تک حرف به شرح زیر نشان داده شود:
روشهای تعیین توالی پروتئین
برای یافتن توالی اسیدهای آمینه پروتئین ها دو روش اصلی وجود دارد. طیف سنجی جرمی به دلیل سهولت استفاده ، متداول ترین روش امروزه است. تخریب Edman با استفاده از یک ترتیب دهنده پروتئین دومین روش است که در صورت نیاز به مشخص شدن انتهای N پروتئین بسیار مفید است.
دانستن اینکه کدام اسید آمینه در انتهای N پروتئین است هم برای قرار دادن قطعات پپتیدی در کل زنجیره و هم برای کاهش تأثیر ناخالصی هایی که معمولاً در دور اول تخریب Edman رخ می دهد ، مفید است. انتهای N را می توان با استفاده از موارد زیر شناسایی کرد:
استفاده از معرف برای برچسب زدن اسید آمینه در انتهای پروتئین.
هیدرولیز پروتئین
استفاده از کروماتوگرافی و سایر روشهای مقایسه برای شناسایی پروتئین مشخص شده.
روش های کمتری وجود دارد که بطور عملی بتوان از آنها برای شناسایی انتهای C پروتئین استفاده کرد. با این حال ، روشی که ممکن است مورد استفاده قرار گیرد شامل افزودن کربوکسی پپتیدازها به محلول پروتئین و گرفتن نمونه های منظم است. رسم غلظت اسیدهای آمینه در برابر زمان می تواند به شناسایی اسید آمینه در انتهای C کمک کند.
تخریب Edman اجازه می دهد توالی اسیدهای آمینه موجود در پروتئین با توالی های Edman کشف شود ، که در حال حاضر قادر به توالی پپتیدهای تا حدود 50 اسید آمینه هستند. این شامل چندین مرحله برای:
برای شکستن هرگونه پل دی سولفید موجود در پروتئین ، از یک عامل کاهنده استفاده کنید.
زنجیره (های) مجموعه پروتئین را جدا کرده و آنها را تصفیه کنید.
ترکیب و اسیدهای آمینه انتهایی هر زنجیره را تعیین کنید.
هر زنجیره را به قطعات کوچک تقسیم کنید (کمتر از 50 اسید آمینه در هر کدام)
قطعات را جدا کرده و تصفیه کنید.
برای تعیین توالی اسیدهای آمینه از قطعات استفاده کنید.
مراحل قبل باید با یک الگوی قطعه متفاوت تکرار شود تا توالی پروتئین کلی با حداقل خطاها بازسازی شود.
ترکیب و تجزیه و تحلیل اسید آمینه
هنگام تلاش برای تعیین توالی ترتیب پروتئین ، ترکیب نامرتب یک اسید آمینه اغلب اطلاعات مفیدی است. دلیل آن این است که می تواند به شناسایی خطاها و تفسیر نتایج مبهم کمک کند. علاوه بر این ، فرکانس اسیدهای آمینه همچنین می تواند به تصمیم گیری در مورد پروتئاز مناسب تر برای هضم پروتئین کمک کند.
برای تعیین فراوانی آمینو اسیدها در فرآیندی که به عنوان تجزیه و تحلیل اسیدهای آمینه شناخته می شود ، دو مرحله اصلی وجود دارد. در مرحله اول ، هیدرولیز مقدار مشخصی از پروتئین باید آن را به مونومرهای اسید آمینه تجزیه کند. سپس می توان با استفاده از روش های مختلف این موارد را از هم تفکیک و تعیین کرد.
هیدرولیز معمولاً با حرارت دادن نمونه ای از پروتئین به بیش از 100 درجه سانتیگراد در اسید کلریدریک برای مدت زمان طولانی (حداقل 24 ساعت) انجام می شود و زمان بیشتری برای پروتئین های دارای گروه های آبگریز حجیم فراهم می شود. از آنجا که خطر تخریب پروتئین در این شرایط وجود دارد ، به ویژه برای سیستئین ، گلوتامین ، سرین ، ترئونین ، تریپتوفان و تیروزین ، توصیه می شود از چندین نمونه استفاده کنید و آنها را برای زمان های مختلف گرم کنید. هنگامی که هیدرولیز شد ، اسیدهای آمینه را می توان جدا کرد و با تکنیک هایی مانند کروماتوگرافی تبادل یونی یا HPLC فاز معکوس شناسایی کرد.
