آزمایشهای آزمایشگاه تشخیص مولکولی شامل استفاده از تکنیک‌های مختلف برای تشخیص و/یا تعیین کمیت نشانگرهای بیولوژیکی خاص در پروتئوم و ژنوم انسانی، ویروسی و میکروبی است. بیماری‌ها با مطالعه DNA، RNA و پروتئینهای موجود در مایع یا بافت، برای دنباله‌های DNA یا RNA که کدگذاری میکنند، شناسایی میشوند.
آزمایشات مولکولی برای سرطان، فارماکوژنومیک (ارزیابی داروهایی که برای فرد مناسب‌تر هستند – پزشکی شخصی)، آزمایش ژنتیک، بیماری‌های عفونی، پیش از تولد، بیماری‌های عصبی، بیماری‌های قلبی عروقی و حتی آنالیز پزشکی قانونی و غیره انجام میشود. تشخیص پاتوژن مانند شناسایی ویروس خاص عفونت‌ها، از جمله عوامل بیماری‌زای تنفسی، ادراری، واژن، مقاربتی، دستگاه گوارش یا سایر عوامل بیماری‌زا بخشی از کار برای شناسایی بیماری‌های عفونی است.
یک نمونه خون ساده برای به دست آوردن اطلاعات ژنتیکی از تومورها، پیوندها یا جنین متولد نشده کافی است. این به این دلیل است که اسیدهای نوکلئیک مورد نیاز برای روش‌های تشخیص مولکولی که قادر به شناسایی نشانگرهای زیستی حساس از نمونه‌های کوچک هستند، در پلاسمای انسان موجود هستند. در نتیجه، این تست‌ها نسبت به نمونه‌برداری سنتی بهتر هستند و همچنین قادر به تشخیص زودهنگام هستند.
آزمایشگاه‌های تشخیص مولکولی تأثیر زیادی در درمان بیماران دارند، زیرا بیماری‌های عفونی و سایر بیماری‌ها زودتر و با دقت بهتری شناسایی و درمان میشوند. برخی از آزمایشات تحت تشخیص مولکولی با شیمی بالینی (بررسی مایعات بدن) و سنجش‌های بیولوژیکی آزمایشگاهی مانند PCR-ELISA یا هیبریداسیون فلورسانس و غیره همپوشانی دارند.
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) محبوب ترین روش در تشخیص مولکولی بر اساس تشخیص اسید نوکلئیک است. PCR برای افزایش تعداد مولکول های اسید نوکلئیک استفاده می شود و در نتیجه توالی(های) هدف در نمونه تکثیر میشود.
در حالی که PCR در حال حاضر پرکاربردترین روش برای تشخیص توالی‌های DNA است، تکنیک‌های دیگری مانند Real Time PCR (qPCR)، توالی‌یابی مستقیم، تست میکرواری، dPCR و غیره نیز در حال گسترش هستند. تراشه های میکرواری تراشه های پیش ساخته ای هستند که نشانگرهای زیادی را همزمان آزمایش میکنند. آرایه های پروتئینی با کارایی بالا می توانند از DNA یا آنتی بادی های مکمل برای اتصال استفاده کنند و از این رو می توانند پروتئینهای مختلف را همزمان شناسایی کنند.
دامنه آزمایش RT-PCR در سال‌های اخیر به دلیل COVID-19 چندین برابر شده است. با این حال، حتی در آینده‌ای بدون آزمایش کووید، انتظار می‌رود RT-PCR / qPCR (همچنین PCR کمی نامیده میشود) یا dPCR (PCR دیجیتال) در مقابل PCR سنتی به دلیل بروز اختلالات ژنتیکی، شیوع بیماری‌های عفونی و رو به رشد پیشرفت کند. استفاده از نشانگرهای زیستی برای تشخیص بیماری‌ها مانند سرطان، CVD و غیره. مزیت روش‌های تشخیص مولکولی نسبت به روش‌های دیگر، مثلاً بیوپسی، این است که کمتر تهاجمی است و فرصتی را برای تشخیص و درمان زودهنگام بیماری زمینه‌ای فراهم میکند.
محصولات اصلی مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص مولکولی شامل تجهیزات/ابزار، معرفها و مواد مصرفی هستند. معرف برای ایجاد یک واکنش شیمیایی استفاده می شود.
مواد مصرفی مورد استفاده عبارتند از:
انواع مختلفی از تجهیزات، معرفها و مواد مصرفی بر اساس فناوری مورد استفاده برای آزمایش استفاده میشوند – توالی‌یابی DNA، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، فناوری تکثیر اسید نوکلئیک همدما، تکثیر با واسطه رونویسی، هیبریداسیون درجا، ریزآرایه‌ها، طیف‌سنجی جرمی، غیره بلات)، الکتروفورز ژل یا مویرگی، آنالیز STR، ترانس کریپتاز معکوس، توالی یابی مستقیم، جداسازی و کمی سازی اسید نوکلئیک و غیره.
با این حال، تمام تجهیزات مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص مولکولی در چهار دسته کلی زیر قرار میگیرند:
?
بسته به دامنه کار، تجهیزات مورد نیاز برای آزمایشگاه تشخیص مولکولی معمولاً شامل موارد زیر است:
از یخچالها برای نگهداری مواد شیمیایی آزمایشگاهی، معرفها، کیتها و سایر محصولات در دمای متوسط ۴ درجه سانتیگراد به علاوه استفاده می شود.
?
از فریزرها برای نگهداری نمونه‌های بیمار و کشت بافتی که منجمد شده‌اند استفاده میشود. به جای استفاده از دو تجهیزات مختلف، میتوان از واحد ترکیبی یخچال و فریزر نیز استفاده کرد. محدوده دمایی مورد نیاز معمولاً از منفی۲۰ درجه سانتیگراد تا منفی ۸۰ درجه سانتیگراد است.
برای مخلوط کردن سریع اجزای مایع در لوله‌ها مانند مخلوط کردن ویالهای کوچک یا تعلیق مجدد سلولها استفاده میشود. این دستگاه از یک موتور الکتریکی با یک محور محرک عمودی متصل به یک فنجان لاستیکی که کمی خارج از مرکز نصب شده است، تشکیل شده است.
?
ممکن است چندین چاه داشته باشد که هر کدام لوله‌های آزمایش را نگه می‌دارند و غیره. موتور فنجان لاستیکی را در یک حرکت دایره‌ای با سرعت‌های ۱۰۰ تا ۳۶۰۰ دور در دقیقه به حرکت در می‌آورد تا یک گرداب یا یک جریان مارپیچی در نمونه ایجاد کند و اختلاط سریع مایعات را امکان‌پذیر کند.
از سانتریفیوژهای یخچالی و غیر یخچالی برای جداسازی قطعات بر اساس چگالی استفاده میشود. میکروسانتریفیوژها همچنین برای مقادیر کوچک نمونه که با سرعت بالا میچرخند استفاده میشود.
?
ترمال سایکلرها تجهیزات کلیدی برای تکثیر بخشهای اسیدنوکلئیک از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) هستند. PCR روشی است که در آن DNA الگو با استفاده از پرایمرهای مصنوعی – یک DNA پلیمراز و dNTPs تکثیر میشود. مخلوطی از نمونه اسید نوکلئیک و پرایمر‌ها بین حداقل 2 دما سایکل میشود: دمای بالا برای دناتوره کردن DNA دو رشته‌ای به مولکولهای تک رشته‌ای و دمای پایین برای هیبرید شدن پرایمر با الگو و برای پلیمراز برای گسترش پرایمر.
هر چرخه دما از نظر تئوری مقدار توالی هدف را دو برابر میکند. تشخیص توالی DNA امپلیفای شده را می توان با استفاده از ترمال سایکلرها تخصصی که قادر به تشخیص فلورسانس هستند، انجام داد.
اسپکتروفتومتر یک ابزار تحلیلی است که برای اندازه‌گیری کمی نور مرئی، اشعه ماوراء بنفش، یا انتشار یا بازتاب نور مادون قرمز به عنوان تابعی از طول موج استفاده میشود. یک پرتو نور از نمونه ماده مورد مطالعه عبور داده میشود. اجزای مختلف نمونه دارای خواص متفاوتی در جذب نور هستند و از این رو نور را به طور متفاوتی منعکس یا عبور میدهند.
?
اسپکتروفتومترها شدت را به عنوان تابعی از طول موج منبع نور اندازه گیری میکنند. در آزمایشگاه تشخیص مولکولی، از اسپکتروفتومترها برای تعیین کمیت اسید نوکلئیک در نمونه استفاده میشود.
توالی یابی DNA برای دانستن توالی چهار حرفی هر ژن یا بخشی از DNA، یعنی توالی آدنین (A)، تیمین (T)، سیتوزین (C) و گوانین (G) استفاده می شود. این برای شناسایی هر گونه ماده ژنتیکی انسانی، ویروسی و میکروبی یا گیاهی ضروری است.
?
میکروسکوپها، به ویژه با دوربین برای مشاهده، ارزیابی نمونه‌ها و ذخیره نتایج استفاده میشوند.
بیشتر مولکولهای زیستی به‌عنوان ذرات باردار الکتریکی در محلولی با pH معین، یون‌های دارای بار مثبت یا منفی، وجود دارند. هنگامی که جریان الکتریکی از یک ژل یا ماتریس دیگر عبور میکند، حرکت مولکولی نسبت به سیال تحت تأثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت فضایی قابل مشاهده است.
از این رو فرآیند الکتروفورز برای جداسازی DNA، RNA (اسید نوکلئیک) یا مولکولهای پروتئین بر اساس اندازه و بار الکتریکی، توالی DNA، تشخیص جهش و غیره استفاده میشود.
اتوکلاو در آزمایشگاهها برای استریل کردن تجهیزات و ابزار آزمایشگاهی استفاده میشود.
?
انکوباتورها برای حفظ شرایط بهینه مانند دما و رطوبت در هنگام رشد و نگهداری کشتها استفاده میشوند.
?
PH متر برای اندازه گیری اسیدیته یا قلیاییت در محلولهای مبتنی بر آب استفاده میشود.
?
میکروتومها برای برش دادن نمونه‌های بافت استفاده میشوند. آنها ابزارهای برشی هستند که برشهای نازکی یا بخشهایی از بافت را تولید میکنند که میتوان آنها را زیر میکروسکوپ یا سایر سیستمهای تصویربرداری سلولی مشاهده کرد و تجزیه و تحلیل کرد.
حمام آب وسیله‌ای است که در آزمایشگاهها برای انکوبه کردن نمونه‌ها در آب نگهداری شده در دمای یکنواخت، کنترل‌شده و ثابت استفاده میشود.
?
ژل داک‌ها برای ثبت و اندازه گیری اسیدنوکلئیک، پروتئینها یا آنتی بادی‌های برچسب دار در انواع مختلف محیط‌ها مانند آگارز، اکریل آمید یا سلولز استفاده میشود. نمونه‌هایی که روی ژل‌های آگارز یا ظروف پتری قرار میگیرند، روی سطح نوردهی UV (فرابنفش) قرار میگیرند و از طریق یک دوربین CCD یا CMOS عکس‌برداری میشوند.
?
کابینت ایمنی زیستی یک کابینت بیولوژیکی ایمن است که اساساً یک فضای کاری آزمایشگاهی محصور و دارای تهویه برای کار ایمن با موادی است که بالقوه آلوده به عوامل بیماری زا هستند. هود لامینار برای انتقال آسپتیک کشت میکروبی استفاده میشود.
الکتروفورز اسید نوکلئیک از یک ماتریس ژل برای جداسازی قطعات DNA و RNA بر اساس اندازه و وزن مولکولی استفاده میکند. قطعات DNA و RNA که توسط الکتروفورز جدا شده‌اند، به صورت بلات به ماتریکس غشایی منتقل میشوند. پروب‌ها برای تشخیص وجود توالی‌های هدف بر روی ماتریس غشا استفاده میشوند. توالی‌های خاص DNA و RNA در یک نمونه به ترتیب با ساترن بلات و نورثرن بلات شناسایی میشوند.
همچنین بخوانید:
مترجم : معصومه قریبی ششده
