مکانیسم انتخاب حمل و نقل در سیتوپلاسم برای مسیر هدف یابی (مقاله ترجمه شده)

خلاصه

عملکرد مناسب اندامکهای یوکاریوتی تا حد زیادی وابسته به بسته بندی خاص پروتئین های حمل و نقل در داخل کیسه های کوچک تحویل گذرا است. مسیر هدف یابی سیتوپلاسم به واکوئل (CVT)، مسیر ترافیک مربوط به اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) است که پروتئین ها، aminopeptidase I و αmannosidase را حمل و نقل می کند، به طور انتخابی از سیتوپلاسم به واکوئل شبه-لیزوزوم مخمر حمل و نقل می شود. این مطالعه، یک مکانیسم مولکولی برای حمل و نقل ویژگی در این مسیر شامل چهار مرحله مجزا را روشن می کند. گیرنده Cvt19، نقش مرکزی را در این فرایند ایفا می کند: حوزه های مجزا در Cvt19، پروتئین محموله چندپاره شده را شناسایی می کند و آنها را به ماشین آلات تشکیل کیسه های کوچک از طریق تعامل با Cvt9 و Aut7 ارتباط می دهد. از آنجا که اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه)، مکانیسم اولیه برای گردش ارگان سلولی است، این نتایج، بینشی را به فرایندهای فیزیولوژیکی در هموستاز سلولی، از جمله بسته بندی خاص اندامکهای آسیب دیده و یا اضافی برای تحویل لیزوزومی و تجزیه بحرانی ارائه می دهد.

مقدمه

مسیر اصلی برای نابودی سلول آسیب دیده یا ارگان سلولی، یک فرایند سلولی مسئول تخریب بخش عمده ای از اجزای سیتوپلاسمی در سلول های یوکاریوتی است. در این فرایند، مواد سیتوپلاسمی به طور غیرانتخابی توسط وزیکول های غشا، دو اتوفاگوزوم به لیزوزوم / واکوئل حمل و نقل  می شود که باید تخریب شود (Klionsky و Ohsumi ، 1999 )  اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه)  ( APG) از شرایط گرسنگی ناشی می شود. اندامکها نیز توسط اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) زمانی که آنها آسیب می بینند و یا دیگر مورد نیاز نیستند دستخوش حذف انتخابی می شوند (Klionsky وEMR ، 2000). علاوه بر این، آنزیم های مقیم حفره از یک فرایند مربوط به اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) به نام مسیر هدف یابی سیتوپلاسم به واکوئل (CVT) بهره برداری  می کنند (Klionsky وOhsumi ، 1999). i Aminopeptidase  ( Ape1)، محموله مسیر CVt (CVT)، در سیتوپلاسم به عنوان یک فرم پیشرو (prApe1) تولید می شود. propeptide prApe1 حاوی اطلاعات هدف یابی حفره می شود (ODA و همکاران، 1996؛ Segui واقعی و همکاران، 1995). پس از سنتز، prApe1 به dodecamer مونتاژ می شود (Kim و همکاران، 1997) که بیشتر در یک ساختار منحصر به فرد به نام کمپلکس CVT (Baba و همکاران، 1997) بسته بندی می شود. این کمپلس متعاقبا توسط یک غشاء دوبل به شکل وزیکول CVT احاطه می شود. این وزیکول سپس با واکوئل برای انتشار تک وزیکول غشای داخلی، بدنه CVT، ترکیب می شود (Baba و همکاران، 1997 ؛ Scott و همکاران، 1997). در دهه گذشته، مطالعات مورفولوژیکی ، ژنتیکی و بیوشیمیایی در مخمر Saccharomyces cerevisiae نشان داده است که اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) ، تخریب پراکسیزوم ( pexophagy ) و مسیر CVt (CVT) یک مکانیزم رایج را برای پیدایش حیات وزیکول های دو غشایی به اشتراک می گذارد که جدا کننده محموله از سیتوپلاسم است ( Klionsky و Ohsumi ، 1999؛ Reggiori و Klionsky ، 2002). با این حال ، مکانیزم مورد استفاده برای ترکیب انتخابی محموله به این وزیکول نامشخص است.

به تازگی، یک پروتئین جدید، به نام Cvt19 ، شناسایی شده است و به عنوان یک گیرنده برای محموله های CVT، prApe1 و mannosidase α (Ams1 ) مشخص می شود ( Hutchins Klionsky ، 2001 ، Scott و همکاران، 2001). Cvt19 یک پروتئین غشای محیطی است. بر خلاف گیرنده های نوع گذرنده از غشاء معمولی که چند دور اتصال و آزادی را به دست می آورند، Cvt19 همراه با محموله خود به واکوئل منتقل و توسط پروتئیناز حفره ای تخریب می شود. تجزیه و تحلیل بیوشیمی و میکروسکوپ فلورسانس نشان می دهد که Cvt19 در درجه اول در یک ساختار پیش حفره ای preautophagosomal  (PAS)، یک محل پیش بینی برای تشکیل وزیکول واقع می شود که در آن بسیاری از اجزای مورد نیاز برای اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) و مسیر CVT واقع می شوند (Scott و همکاران، 2001 ، Suzuki و همکاران، 2001، Kim و همکاران، 2002 ؛ Noda و همکاران، 2002). از این نتایج، Cvt19 برای عمل نمودن در مرحله ای پیشنهاد می شود که در آن کمپلکس CVT به PAS هدف یابی می کند. با این حال، روشن نیست چگونه Cvt19 در به این محل موقعیت یابی می شود. اگرچه اجزاء خاص برایCVT و مسیرهای pexophagy ، مانند Cvt9، شناسایی شده اند (Scott و همکاران، 2000 ؛ Kim و همکاران، 2001b ؛ . nice و همکاران، 2002) ، رابطه بین Cvt19 و این پروتئین ها هنوز نامعلوم است.

نتایج

GFP-Ape1 توسط مسیرهای CVT و اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) به واکوئل منتقل می شود

I (Ape1)  Aminopeptidas هیدرولاز ساکنی است که از طریق مسیر هدفیابی سیتوپلاسم به واکوئل (CVT) به واکوئل حرکت می کند. propeptide N-ترمینال حاوی اطلاعات هدف یابی حفره است و به روش وابسته به پروتئیناز حفره ای (Pep4) پس از تحویل شکافته می شود (شکل 1a، خطوط 2 و 5، Klionsky و همکاران، 1992؛ 1996 ODA و همکاران). تا به امروز، بسیاری از مطالعات اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) روی تجزیه و تحلیل دستگاه های تشکیل وزیکول متمرکز شده است. برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد CVt (CVT) و معابر APG، ما تصمیم به بررسی واردات محموله پیش ساز پروتئین Ape1  (prApe1) در داخل بدن گرفتیم.

Propeptide prApe1 برای موقعیت یابی مناسب آن و تعامل با یک پروتئین گیرنده مورد نیاز است.

propeptide prApe1 برای واردات prApe1 به واکوئل ضروری است، اما برای اولیگومریزاسیون آن لازم نیست (ODA و همکاران، 1996 ؛ 1997 Kim و همکاران). یک پیش بینی ثانویه ساختار پیشنهاد داد که در که propeptide prApe1 به شکل یک ساختار مارپیچ-دور-مارپیچ است و اینکه اولین مارپیچ ( باقیمانده 1-18 ) نمایشگر ویژگی های amphipathic α مارپیچ است که برای ارتباط غشاء و فرآیندهای غشایی (ODA و همکاران، 1996) مهم است. جهش در این منطقه (به عنوان مثال، حذف باقی مانده های 9-11 ، 9-11) از ارتباط prApe1 با غشاء جلوگیری می کند و در نتیجه حمل و نقل آن به واکوئل را مهار می کند. از سوی دیگر، جایگزینی پرولین با لوسین در موقعیت 22 ( P22L ) باعث تجمع prApe1 در ساختار غشاء غیرحفره ای می شود، اما واردات prApe1 را به واکوئل مسدود می کند ( 1997 ODA و همکاران، 1996، Scott و همکاران) است. بنابراین ما سعی کردیم مرحله ای را در مسیر CVt (CVT) تعیین  کنیم که از این جهش ها در prApe1 propeptide تحت تاثیر قرار می گیرد. ما بوسیله میکروسکوپ فلورسانس برای اولین بار تصمیم به بررسی موقعیت یابی prApe1 از جهش propeptide با استفاده از ساختار GFP در کششape1 α گرفتیم. GFP - Ape1 نوع-وحشی، یک رنگ آمیزی lumenal حفره ای قابل توجه را با سیگنال های خال خال کوچک اضافی در منطقه پیش حفره ای (شکل 2A) ارائه می دهد. در مقابل، GFP - Ape1 α 9-11 به طور یکنواخت در سیتوزول (شکل 2A ) توزیع می شود که موافق با تجزیه و تحلیل های بیوشیمیایی قبلی است. این نتیجه نشان می دهد که اولین مارپیچ amphipathic α در تشکیل کمپلکس Ape1 درگیر است. در مقابل،GFP - Ape1P22L یک سیگنال بزرگ تک خال خال را دور از واکوئل (شکل 2A ) ارائه داد که نشان می دهد که Ape1P22L هنوز قادر به تشکیل Ape1 پیچیده است، اما در موقعیت یابی PAS نقص دارد.

کمپلکس Ape1-Cvt19 توسط Cvt9 تا PAS هدفمند است.

اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) یک فرایند غیرانتخابی است و سیتوپلاسم غیر اختصاصی را محصور می کند. در مقابل، مسیر CVt(CVT) و وارداتprApe1 توسط اتوفاژی (مکانیزم اصلی کاتابولیک شامل تخریب سلول یا اجزای سلولی بدون وظیفه) خاص، احتمالا به دلیل تعامل بین prApe1 و Cvt19است. با این حال، این حوزه درون Cvt19 که به prApe1 متصل می شود، شناخته شده نیست. علاوه بر این، محل دقیق Cvt19 در PAS به عنوان یک رویداد مهم برای هدف یابی انتخابی prApe1 به نظر می رسد که به ما اجازه می دهد تا فرض کنیم که یک دامنه در Cvt19 برای تعیین موقعیت یابی آن در PAS وجود دارد. به این دلایل، ما برای شناسایی عمل PASتلاش نمودیم. به این دلایل، ما برای شناسایی حوزه های عملکردی در پروتئین Cvt19تلاش نمودیم. Cvt1، یک پروتئین اسید آمینه 415 حاوی دامنه مارپیچ پیش بینی شده از سیم پیچ بین اسیدهای آمینه 160 و 187 (شکل 3A) است. ما چند حذف Cvt19 N و C-ترمینال حذف را ایجاد نمودیم، به عنوان مثال Cvt19 15C نشان دهنده جهش فاقد C-ترمینال 15 اسید آمینه است. از آنجا که شکل مارپیچ اغلب واسطه تعامل پروتئین-پروتئین است، ما همچنین جهش Cvt19 CC را ساختیم که فاقد منطقه 39 اسید آمینه از باقی مانده های 153 تا 191 است که حاوی یک دامنه مارپیچ از سیم پیچ می شود (شکل 3A). حوزه اتصال prApe1 برای اولین بار توسط مخمر سیستم دو هیبریدی مورد بررسی قرار گرفت. فشار آزمون cvt19Δ با ژن LacZ تحت کنترل یک پروموتر وابسته به GAL4 با prApe1 و جهش Cvt19 پلاسمیدها تبدیل شد، و فعالیتα-گالاکتوزیداز به بررسی تعامل اندازه گیری شد. تمام پروتئین های Cvt19 حاوی دامنه مارپیچ به طور موثر با prApe1 تعامل نمود، در حالی که آنهایی که فاقد این دامنه بودند هیچ تعاملی را (شکل 3A) نشان ندادند.

PreApe1 Cargo Ams1، Cvt9 و دیگر Arms1 پروتئین محموله به سمت گنجاندن های وزیکول های Cvt هدایت می کند

Cvt19 به عنوان یک نتیجه از واردات به واکوئل تخریب می شود، و نیمه عمر آن در سلول ape1 چهار برابر بیشتر از نیمه عمر آن در سلولهای نوع وحشی (Scott و همکاران، 2001) است. این باعث شد که ما بررسی کنیم که آیا یکی دیگر از پروتئین های باری، α mannosidase (Ams1)، می تواند روی واردات Cvt19 تاثیر بگذارد یا خیر. ما آزمایش فاز-پالس را برای نظارت بر حمل و نقل preApe1 و Cvt19 برای واکوئل انجام دادیم. در ams1α، با این حال، تخریب Cvt19 قابل مقایسه با تخریب سلول های نوع وحشی (شکل 5A) بود. علاوه بر این، حذف AMS1 به هرگونه تغییر در فرآوری prApe1 (به شکل 5A) منجر نشد. این نتایج با میکروسکوپ فلورسانس، که موقعیت یابی طبیعی GFP-Cvt19 و GFP-Ape1 را در سلول های ams1 نشان داد حمایت می شدند (شکل 5B). در مقابل، Cvt19 در سلولهای ape1α تثبیت شد که مشابه با نتیجه دیده شده در سلول های apg1α (شکل 5A)، در توافق با مطالعات قبلی است (Scott و همکاران، 2001). این نتایج نشان داد که prApe1، اما نه Ams1، برای واردات های مناسب Cvt19 به واکوئل لازم است. به منظور بررسی در بیشتر آثار prApe1 در واردات Cvt19، ما محل GFP-Cvt19 را در apg1 در مقایسه با سلول های α و ape1α مقایسه نمودیم. همانطور که از موقعیت یابی GFP-Ape1 در سلول های apg1 انتظار می رفت، GFP-Cvt19 نیز در محل مجاور به واکوئل در فشار apg1، α متمرکز شده است (شکل 5B). در مقابل، در سلول های ape1α، GFP-Cvt19 به طور یکنواخت در سیتوپلاسم (شکل 5B)، سازگار با توزیع پراکنده GFP-Cvt19، 263C و GFP-Cvt19 فاقد دامنه اتصال prApe1 (شکل 3D) توزیع شد. در مجموع، این نتایج پیشنهاد می کند که کمپلکس Ape1 از طریق تعامل بین prApe1 و Cvt19 متمرکز می شود.

این مقاله ISI در سال 2002 در نشریه الزویر و در مجله سلول رشدی، توسط گروه‌ های زیست‌ شناسی مولکولی منتشر شده و در سایت ای ترجمه جهت دانلود ارائه شده است. در صورت نیاز به دانلود رایگان اصل مقاله انگلیسی و ترجمه آن می توانید به پست دانلود ترجمه مقاله مکانیسم انتخاب حمل و نقل در سیتوپلاسم برای مسیر هدف یابی در سایت ای ترجمه مراجعه نمایید.