واکنش زنجیره‌ای پلیمرازPCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR (Poly Chain Reaction روشی است که به محققان اجازه می دهد تا به سرعت، نسخه‌های یک منطقه خاص از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی تکثیر کنند.

برای اطلاع از قیمت دستگاه PCR مورد نظر به صفحه لیست قیمت شرکت سر بزنید. کمپانی Techne تولید کننده دستگاه‌های real time می‌باشد.

برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا PCR به چه چیزی نیاز دارید؟

• الگو (Template) یا قطعه خالص از دو رشته‌ای از DNA که می‌خواهید آن‌ را کپی کنید.
• آغازگرها(Primers) یا مولکول‌های DNA مصنوعی کوتاه که یک دنباله DNA خاص را برای تکثیر هدف قرار می‌دهند.
• آنزیم تگ پلیمراز(Taq DNA Polymerase )
  این آنزیم یک آنزیم پلیمرازی است که از باکتری گرمادوست Thermus Aquaticus استخراج شده است.
• این باکتری در چشمه های آب گرم یافت می شود و بسیار مقاوم به گرما میباشد به همین علت آنزیم Taq بسیار مقاوم به حرارت است.
  آنزیم تگ در واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR به فراوانی مورد استفاده قرار می گیرد.
• برتری های آنزیم تگ پلیمراز K.T.G :
• دارای ویال جداگانه حاوی بافر 10X جهت بهبود عملکرد آنزیمی برای
• درجه های بالای ساختارهای ثانویه و نقاط غنی از نوکلئوتیدهای G/C
• دارای ویال جداگانه MgCl2
• مناسب برای T/A کلونینگ
• دارای مقاومت به مدت دوسال در دمای 20- درجه سانتیگراد
• نوکلئوتیدهای آزاد به عنوان واحد‌های ساختاری سازنده DNA مورد استفاده آنزیم قرار گرفته و طویل سازی انجام می شود.
• ترموسایکلر(دستگاه PCR) یک دستگاه تخصصی است که به سرعت نمونه‌ها را گرم و سرد می‌کند.
• کاتیون‌های دو طرفیتی نظیر یون دوظرفیتی منیزیم .
• مسترمیکس آماده تگ 2X Taq Premix :
  مسترمیکس چیست؟
  مسترمیکس ، مخلوطی از مواد واکنش (آنزیم تگ- نوکلئوتیدهای آزاد-کاتیون های دو ظرفیتی منیزیم-بافر) بصورت آماده است
• که برای کاربر بهبود عملکرد را به همراه دارد.
• مسترمیکس تگ 2X Taq Premix شرکت K.T.G:
• مخلوطی از آنزیم Taq پلیمراز، dNTP ها، رنگ Loading Dye، بافر مخصوص، MgCl2 و تثبیت کننده پروتئین است که
• صرفا نیازمند پرایمرهای فروارد و ریورس و رشته DNA الگو می باشد.
• برتری های مسترمیکس K.T.G :
• کاهش خطاهای فنی
• عدم نیاز به اضافه نمودن رنگ Loading Dye به نمونه الکتروفورز
• مقرون بصرفه

مکانیسم انجام PCR

برای انجام (PCR (Poly Chain Reaction ، الگو که همان مولکول DNA می باشد با پرایمرها، آنزیمTaq پلیمراز و نوکلئوتیدها مخلوط می‌شود. مخلوط واکنش تا دمای 94 درجه سانتیگراد به منظور واسرشتگی رشته DNA بالا می‌رود. (واسرشته سازی)

در مرحله بعد، دمای دستگاه تا 45 درجه سانتیگراد و 60 درجه سانتیگراد پایین می‌آید و به آغازگر یا همان پرایمر‌ها اجازه اتصال به ناحیه مکمل خود بروی الگو را می‌دهد. ( اتصال)

در آخر، با افزایش دما تا 72 درجه سانتی گراد، دمای بهینه جهت شروع عملکرد آنزیم برای سنتز ایجاد می‌شود. ( طویل شدن) رشتهDNA در هر سیکل PCR (واسرشته سازی ، اتصال، طویل شدن) دو برابر می‌شود. به منظور تولید DNA کافی برای تجزیه و تحلیل، ممکن است بیست تا چهل چرخه مورد نیاز باشد.

تجهیزات مرتبط

برای انجام این واکنش به وسایلی نظیر سمپلر، سر سمپلر کریستالی، میکروتیوب، تانک الکتروفورز، میکروفیوژ و ... مورد نیاز است.

در نهایت برای جداسازی و مشاهده نتیجه PCR انجام شده و باندهای مورد نظر، از الکتروفورز افقی و ژل آگارز و ژل داک استفاده می شود.

به منظور داشتن مرجعی برای بررسی اندازه باندهای درون ژل، درون چاهک‌های ژل، در کنار نمونه‌های PCR ، یک نمونه مرجع یا همان Ladder لود می‌شود.

برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد الکتروفورز بروی کلمه کلیک کنید.

کاربرد واکنش زنجیره‌‌ای پلیمراز یا PCR :

کاربردهای PCR شامل موارد زیر می‌باشد:

تشخیص پیش از تولد

تشخیص بیماری‌ها

تحقیقات جنایی

انگشت نگاری ژنتیک

تعیین توالی ژنومی

تعیین جنسیت جنین

تشخیص سرطان

کلونینگ و ...

نکاتی که باید به آن توجه نمود:

برای اضافه کردن هر ماده به ویال واکنش از سر سمپلرهای جداگانه استفاده کنید. استوک یا منابع ذخیره مواد مورد استفاده را حتما در فریزر نگه داری کنید و هر چند وقت یکبار صحت آن‌ها را کنترل کنید.

قبل از استفاده از هر ماده، به منظور یکدست شدن ماده، از ورتکس استفاده کنید. نمونه‌های کنترل منفی و مثبت را در کنار نمونه‌های آزمایش، در ژل الکتروفورز RUN کنید.

انواع مختلف واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا PCR :

PCR چیست؟

انواع مختلف واکنش‌هایPCR وجود دارد.

کاربران با توجه به نیاز خود، ازPCR های مختلف استفاده می‌کنند.

در اینجا توضیح مختصری در مورد انواع مختلف PCR ارائه شده است.

انواعPCR:

1. RT-PCR : از این روش برای رونوشت برداری معکوس استفاده می‌شود. با استفاده از آنزیم ریورس ترنسکیپتاز، DNA به مولکول RNA تبدیل می‌شود. در ادامه با اضافه کردن مواد، تبدیل RNA بهcDNA انجام می‌شود. می توانید از کیت های مخصوص ساختcDNA استفاده نمایید.

cDNA Synthesis Kit کیت ساخت cDNA شرکتK.T.G:

cDNA چیست؟
فرآیند ساخت تک رشته DNA، از رشته RNA یا mRNA به عنوان الگو توسط

آنزیم رونوشت بردار معکوس(Reverse Transcriptase) را ساخت cDNA می نامند.
این کیت شامل:
محلول 2X RT-premix
محلول Enzyme Mix
10X Buffer

2. Ligation-mediated PCR : اینPCR شبیه یک PCR کلاسیک می‌باشد و فقط یک مرحله استفاده از آنزیم لیگاز به آن اضافه شده است. از این روش برای توالی یابی ژنومی و ... استفاده می‌شود. ابتدا یک لینکر یا آداپتور به مولکول DNA متصل می شود، سپس پرایمر یا آغازگرهای طراحی شده برای این توالی های لینکر، به فرآیند انجام واکنش اضافه شده و مراحل بعدی ادامه می‌یابد.

3. (Methylation-specific PCR ( MSP: این روش برای شناسایی الگوهای متیلاسیون مولکول DNA

در جزایر سیتوزین گوانین(CpG) در DNA ژنومی استفاده می‌شود.

4. Multiplex-PCR : از چندین جفت آغازگر برای توالی هدف مختلف استفاده می‌کند.

5- Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR : برخی از توالی‌ها در مولکول DNA

به صورت توالی‌های پشت سر هم، تکرار می‌شوند. تعداد تکرار این توالی‌ها در یک آلل در افراد مختلف، متفاوت است.

این روش PCR برای شناسایی این مناطق، انجام می‌شود.

برای شناسایی والدین، انگشت نگاری و جرم مورد استفاده قرار می‌گیرد.

از انواع دیگر PCR می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

6. Asymmetric PCR : این روش ترجیحاً یک رشته از DNA مورد هدف را تکثیر می‌کند.

7. Nested PCR : در این روش از دو سری پرایمر یا آغازگر استفاده می‌شود. محصول PCR اول، به عنوان الگو برای واکنش PCR دوم مورد استفاده قرار می‌گیرد. از این PCR برای افزایش اختصاصیت محصول تکثیر شده استفاده می‌شود.

8.Quantitative PCR : برای اندازه گیری مقدار مشخصی از DNA مورد نظر(یا RNA) در یک نمونه استفاده می‌شود.

9. Hot-start PCR : در این روش تمام مواد به ویال واکنش اضافه شده و در دستگاه تا دمای 95 درجه سانتی گراد، حرارت دهی می شوند.

قبل از شروع سیکل‌های بعدی، دستگاه را متوقف کرده و آنزیم پلی مراز به صورت دستی به مخلوط واکنش اضافه می‌گردد.

برای این واکنش می توانید از آنزیم Hot Start Taq DNA Polymerase شرکتK.T.G استفاده نمایید.

آنزیم هات استارت تگ پلیمراز چیست؟
این DNA پلیمراز، مخلوطی از Taq DNA پلیمراز و یک مهارکننده مبتنی بر آپتامر حساس به دما است. این مهارکننده به طور برگشت پذیر به آنزیم متصل می گردد و فعالیت آنزیم را در دمای پایین تر از 40درجه سانتیگراد مهار می کند.

برتری های آنزیم هات استارت K.T.G :

• کاهش پرایمر دایمر
• بی نیاز به زمان فعال سازی
• جلوگیری از تشکیل باندهای غیر اختصاصی
• پایدارتر از Taqهای هات استارت مبتنی بر آنتی بادی
• مقرون بصرفه تر از Taqهای هات استارت مبتنی بر آنتی بادی

10. Touchdown PCR : در این تکنیک ، درجه حرارت آنیل در چرخه‌های بعدی به تدریج کاهش می‌یابد. از این روش برای به دست آوردن دمای دقیق اتصال پرایمر به توالی DNA، استفاده می‌شود.

11. Assembly PCR یاPCA : از این روش برای اتصال الیگونوکلئوتیدهای دارای نواحی هم پوشان و ایجاد یک ژن کامل استفاده می شود.

12. Colony PCR : این تکنیک برای غربالگری وکتورهای باکتریایی نوترکیب و غیر نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد.

13. Digital PCR یاdPCR : برای اندازه گیری مقدار دقیقDNA و یا RNA مشابهReal-time PCR مورد استفاده قرار می‌گیرد

ولی برخلاف Real-time به آنالیز منحنی ها نیازی ندارد.

برای کسب اطلاع از قیمت انواع دستگاه هایPCR موجود در هلدینگ KTG به صفحه لیست قیمت پی سی آر مراجعه کنید.

همچنین می توانید جهت خرید دستگاهPCR با کارشناسان ما در تماس باشید.

منبع: هلدینگ KTG

مقاله: واکنش زنجیره‌ای پلیمرازPCR