کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) فرآیند جداسازی اجزا در یک مخلوط مایع است. یک نمونه مایع به یک جریان حلال (فاز متحرک) تزریق می شود که از طریق یک ستون بسته بندی شده با یک محیط جداسازی (فاز ثابت) جریان می یابد. اجزای نمونه در حین عبور از ستون با فرآیند مهاجرت تفاضلی از یکدیگر جدا می شوند.
همانطور که نوارها از ستون بیرون می آیند، جریان آنها را به یک یا چند آشکارساز می برد که یک پاسخ ولتاژ را به عنوان تابعی از زمان ارائه می دهد. به این کروماتوگرام می گویند. برای هر پیک، زمانی که در آن پدیدار می شود، جزء نمونه را با توجه به یک استاندارد مشخص می کند. مساحت قله نشان دهنده کمیت است.
اجزای اصلی سیستم HPLC
حالت های شستشوی ایزوکراتیک در مقابل گرادیان
شستشوی ایزوکراتیک
شستشوی گرادیان
حالت های پمپاژ شستشوی ایزوکراتیک و گرادیان
پمپ ایزوکراتیک
پمپ تک کانالی که کاربر را ملزم می کند فاز متحرک را از قبل مخلوط کند. ترکیب با گذشت زمان ثابت می ماند.
پمپ گرادیان کم فشار کواترنر
یک پمپ 4 کانالی که مخلوطی از کانال های حلال جداگانه را تحت کنترل نرم افزار ایجاد می کند. مخلوط کردن قبل از سر پمپ انجام می شود. ترکیب ممکن است با گذشت زمان تغییر کند.
پمپ گرادیان فشار بالا باینری
یک پمپ 2 کاناله که مخلوطی از 2 حلال را تحت کنترل نرم افزار ایجاد می کند. اختلاط پس از سر پمپ انجام می شود. ترکیب ممکن است با گذشت زمان تغییر کند.
ستون LC توصیه شده:
شیمی ستون: به عنوان مثال C18، C8، C4، فنیل-هگزیل، فرمت ستون بی فنیل: 100 x 3 میلی متر، ذرات 2.7 تا 5 میکرومتر
گرادیان غربالگری – قدرتمند برای توسعه روش
تفسیر: برای ستون LC فاز معکوس که در آن A آب است و B آلی است، این اولین اجرا اجزای نمونه را نشان می دهد که همه قطبی هستند. بنابراین، جداسازی ضعیف است زیرا مواد در فاز ثابت تقسیم کمی را تجربه می کند. به عبارت دیگر، شرایط حلال ضعیف و در شروع، ترکیبات نمونه را خیلی زود از بین می‌برد.
برای اینکه مواد بیشتر به فاز ساکن تقسیم شوند، شیب گرادیان را کاهش می دهیم تا استحکام فاز متحرک به سرعت افزایش پیدا نکند. مواد برای مدت طولانی تری باقی می مانند و شروع به جدا شدن از یکدیگر می کنند. توجه داشته باشید که ما همچنان ستون را با حلال قوی در پایان اجرا می‌شوییم تا به طور موثر ستون را تمیز کنیم.
ما شیب گرادیان را دوباره کاهش می دهیم تا زمانی که شروع به دیدن یک جداسازی خوب در بازه زمانی کنیم.
آشکارسازهای UV/Vis
آشکارسازهای فتودیود آرایه (PDA)
آشکارسازهای فلورسانس (FLD)
آشکارسازهای ضریب شکست(RID)
آشکارسازهای پراکندگی نور تبخیری
آشکارسازهای طیف سنجی جرمی(MS)
ستون های HPLC با ذرات سیلیس متخلخل بسته بندی شده اند.
ملاحظات هنگام انتخاب ستون
تصمیم “بهترین” فاز ثابت برای جداسازی باید بر اساس حلالیت نمونه و تفاوت های شیمیایی بین اجزای نمونه باشد.
تصمیم گیری در مورد ابعاد ستون باید بر اساس اهداف کروماتوگرافی باشد.
شیمی فازهای پیوندی
بسته بندی فاز پیوندی با سطح سیلیسی خالی شروع می شود
از طریق واکنش شیمیایی، اتصال فاز پیوند اولیه حاصل می شود.
تولیدکنندگان به میزان پوشش فاز پیوندی بر حسب درصد بار کربن اشاره می کنند.
بیشتر سطح سیلیس بدون واکنش باقی می ماند – برخی از گروه های سیلانول سطحی هنوز در معرض قرار دارند.
اغلب، یک مرحله پیوند ثانویه، مولکول‌های کوچکتر «درپوش انتهایی» را بین رشته‌های فاز باند اولیه وارد می‌کند. این درپوش های انتهایی ممکن است قطبی یا غیر قطبی باشند.
ستون‌های مختلف از یک نوع فاز پیوندی از نظر قرار گرفتن در معرض سیلانول و پوشش انتهایی متفاوت خواهند بود، که منجر به طیفی از قطبیت‌های کلی مختلف و توانایی جداسازی متفاوت می‌شود.
شیمی فاز پیوندی مشترک
انتخاب های شیمی ستون بر اساس حلالیت نمونه
پدیده احتباس آبگریز
ستون‌های فاز معکوس دارای فاز پیوندی روی سطح ذرات سیلیس هستند که ماهیت آبگریز دارد. به عنوان مثال می توان به C30، C18، C8، C4 اشاره کرد.
در اصل، “مانند، مانند را تجزیه می کند”. چنین ستونی تمایل به حفظ اجزای نمونه را دارد که آبگریز نیز هستند، تا زمانی که فاز متحرک در جذب آن برای آن جزء نمونه قوی‌تر نباشد. اجزای نمونه قطبی بیشتر تمایل دارند سریعتر از ستون خارج شوند زیرا به میزان کمتری حفظ می شوند.
برای یک ستون فاز معکوس، از ترکیبی از حلال‌ها استفاده کنید که قطبیت کلی «بزرگ‌تر» (کمتر آبگریز) را نسبت به فاز ساکن ایجاد می‌کنند. به این ترتیب، اجزای نمونه دلیلی برای جذب شدن به فاز ساکن (فاز باند ستونی) و مقاومت در برابر تمایل به جریان با فاز متحرک (حلال) دارند.
از “ضعیف ترین” یا قطبی ترین شرط لازم برای تمایز بین اجزای نمونه در حین عبور از ستون استفاده کنید.
نمونه هایی از جفت حلال های رایج فاز متحرک عبارتند از: استونیتریل/آب و متانول/آب. تغییر نسبت آلی/آب قطبیت کلی آن را تغییر می دهد.
نمونه ای از احتباس آبگریز
مولکول های زیر به راحتی روی ستون C8 فاز معکوس با استفاده از 50/50 استونیتریل/آب جدا می شوند. آلانین قطبی ابتدا از ستون و سپس ترفنیل غیر قطبی شسته می شود.
ارتباط با ما
آدرس : تهران - میرداماد - خیابان کازرون شمالی - کوچه نیک رای - پلاک 3 - طبقه 6 - واحد 13
شماره تماس : 02175311 - 02122919474 - 02122919720
شماره واتساپ : 09199060602
ایمیل : sales1.vtk@gmail.com
وب سایت : https://partogene.com
دستگاه HPLC, اتوسمپلر دستگاه HPLC, پمپ HPLC, دتکتور, دتکتور uv/vis, دتکتور برای HPLC, دتکتور ضریب شکست(RID), دتکتور طیف سنجی جرمی(MS), دتکتور فتودیود آرایه (PDA), دتکتور فلورسانس (FLD), دتکتور فلورسانس یا FLD, ستون های HPLC, کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا, گاز زدا حلال
