کنترل کیفی الایزا

کنترل کیفی الایزا:

کنترل کیفیت در آزمایشگاه به کلیه روش‌ها و دستورالعمل‌هایی گفته می‌شود تا نتیجه فرآیند هم از نظر دقت و هم از لحاظ صحت مورد تأیید قرار بگیرد، به همین منظور در رابطه با تست الایزا مباحث کنترل کیفی در موارد زیر دنبال می‌شود:

۱- برای شناسایی تمامی داده‌های غیر قابل قبول

۲- برای ردیابی روند نتایج (دور شدن از نمودار کنترل)

۳- برای تحقق بخشیدن به الزامات لازم برای شناخت خارجی که آزمون‌ها در سطح قابل قبول انجام می‌شود (زمانی که نتایج برای اهداف تجاری بین‌المللی مورد استفاده قرار می‌گیرند، مهم‌تر است .)

تعیین شاخص‌های عملکردی کیت‌های الایزا

حساسیت تشخیصی (Diagnostic sensitivity)

شامل تعداد افراد بیماری است که دارای آزمایش مثبت هستند و ارزش اصلی آن شناساندن افراد بیماری است که نتیجه آزمایش منفی دارند (گروه منفی کاذب).

ویژگی تشخیصی (Diagnostic specificity)

ویژگی تشخیصی شامل تعداد افراد غیربیمار است که آزمایش منفی دارند و ارزش اصلی آن تعیین افراد غیربیماری است که نتیجه آزمایش مثبت دارند (گروه مثبت کاذب).

روش اندازه‌گیری ویژگی تشخیصی و حساسیت تشخیصی در کیت‌های الایزا

۱- اندازه‌گیری بر روی تعداد زیادی نمونه سرم کنترل مثبت و منفی (یا سرم رفرانس)

۲- جداسازی افراد بیمار از غیربیمار با روش‌های استاندارد و مرجع

۳- مقایسه دو روش اندازه‌گیری معمول و روش مرجع و محاسبه آماری شاخص‌ها (۴)

شاخص‌های اجرایی در کیت‌های الایزا

نخستین گام در ارزیابی کیت‌های الایزا تعیین شاخص‌های اجرایی برای آن است.

این شاخص‌ها از نظر تعریف شامل کلیه آزمایش‌هایی هستند که دقیق و صحیح بودن عملکرد یک کیت را نشان می‌دهند. بسته به کمی یا کیفی بودن کیت‌های الایزا این شاخص‌ها متفاوت هستند. در کیت‌های کمی در مرحله نخست پس از اطمینان از درست بودن منحنی استاندارد کیت و منطبق بودن آن با منحنی معرفی‌شده از سوی سازنده اقدام به بررسی شاخص‌های اجرایی می‌نمایند (۷).

این شاخص‌ها به ترتیب عبارتند از:

۱- دقت یا بررسی تکرارپذیری کیت (precision)

۲- صحت یا بررسی صحیح بودن (Accuracy)

۳- حساسیت

دقت (precision)

نخستین معیار مهم در شاخص‌های اجرایی مسئله دقت در کیت‌های آزمایشگاهی است. دقت به معنی تکرارپذیری یک آزمایش است. برای محاسبه آن در اولین مرحله نیاز به تهیه یک نمونه ثابت داریم. این نمونه می‌تواند پولد سرم (مخلوط سرمی)، سرم کنترل تجاری، سرم کنترل کیت یا هر نمونه‌ای باشد که مقدار پایدار و ثابتی دارد. دومین نکته‌ای که بهتر است به آن توجه شود این است که به‌جای یک نمونه، سه نمونه را به‌صورت جداگانه مورد آزمایش قرار دهیم. این سه نمونه در اصل حاوی مقادیر بالا، متوسط و پایین آنالیت موردنظر ما خواهند بود و این اطمینان را به ما می‌دهند که در این سه طیف، کیت دارای نتایج تکرارپذیری است. پس از تهیه نمونه، دومین اقدام تعریف سطح تکرارپذیری یا در اصل طبقه‌بندی دقت است؛ از همین رو دقت را می‌توان به انواع مختلفی طبقه‌بندی کرد:(۴)

درون سنجی (intra-assay)

در این نمونه دقت، می‌بایست با یک نمونه، وضعیت تکرارپذیری را در طی یک آزمایش کاری و درون یک پلیت مورد ارزیابی قرار داد. این نوع دقت توانایی یک روش را برای تعیین مقدار یک نمونه در یک آزمایش ارزیابی می‌نماید.

برای انجام این کار چندین استریپ از یک پلیت را با یک نمونه مورد آزمایش قرار می‌دهیم (حداقل۲۰ بار ) و نتایج حاصله را ثبت می‌کنیم. جهت محاسبه می‌بایست دقت نمود تا از غلظت بدست‌آمده و نه OD ، جهت محاسبات استفاده نماییم، از همین رو نخست میانگین کلیه غلظت‌ها X را محاسبه نموده و انحراف استاندارد (SD) آنها را بدست می‌آوریم. با تقسیم انحراف استاندارد بر میانگین و ضرب آن در عدد۱۰۰، ضریب تغییرات (CV%) بدست می‌آید که نشان‌دهنده میزان پراکندگی نتایج بدست آمده است.

CV% = SD/ X × ۱۰۰

با ترسیم ضریب تغییرات در غلظت‌های مختلف می‌توان منحنیی بدست آورد که آن را گزارش دقت PRECISION PROFILE می‌نامند و می‌توان از آن برای تعیین طیف کاری که بیشترین میزان تکرارپذیری را دارا باشد، استفاده نمود (دستورالعمل آزمایشگاه رفرانس).

میان سنجی (Inter-assay)

اهمیت این نوع دقت در این نکته است که توانایی یک روش را در تعیین مقدار یک نمونه در طی آزمایشا ت متعدد می‌سنجد.

برای تعیین این نوع دقت دو راه وجود دارد:

روش نخست در طی دو آزمایش مختلف در طی یک روز و با فاصله ۲ ساعت از یکدیگر انجام می‌گیرد. برای تعیین این نوع دقت که مشهور به‌دقت مابین آزمایشی between -Run Precision است، می‌بایست در هر بار انجام آزمایش هر نمونه را چهار بار مورد آزمایش قرار داد و محاسبات نیز همانند قبل انجام می‌گیرد.

در روش دوم مابین روزهای مختلف نتیجه آزمایش را بررسی می‌کنیم Between -day precision . در این روش نیز نمونه مورد آزمایش در هر بار انجام آزمایش می‌بایست چهار بار تست شود (۷).

صحت (Accuracy)

صحت در اصل بیانگر مقدار واقعی یک آزمایش است و میزان نزدیک بودن میانگین آنالیت‌های اندازه‌گیری‌شده را با مقدار واقعی آن مورد بررسی قرار می‌دهد. به اختلاف حاصل از این دو، عدم صحت یا سوگرایی یا Bias می‌گویند.

بررسی تداخلات (interference)

یکی از موارد مهم مؤثر بر روی صحت یک کیت، مسئله تداخلات است. تداخلات می‌توانند هم باعث سوگرایی مثبت و یا نتایج مثبت کاذب و هم سوگرایی منفی و یا نتایج منفی کاذب در آزمایش‌ها گردند. از عوامل مختلفی که باعث بروز تداخل می‌گردند می‌توان به تأثیر هتروفیل آنتی‌بادی، فاکتور روماتوئیدی و اثر هوک اشاره کرد. آنتی‌بادی‌های هتروفیل گروهی از آنتی‌بادی‌ها هستند که در پی تماس مستقیم و یا غیرمستقیم با حیوانات در انسان ایجاد می‌شوند. این آنتی‌بادی‌ها با چسبیدن به قسمت‌های FC ملکول‌های آنتی‌بادی می‌توانند باعث سوگرایی مثبت و منفی در آزمایش‌ها شوند. فاکتور روماتوئیدی از عوامل دیگر تداخل‌کننده محسوب می‌شود. جنس این فاکتور از جنس IgM بوده و علیه قسمت FC مولکول‌های IgG است. این فاکتور را می‌توان در بسیاری از بیماران مبتلا به بیماری‌های خود ایمنی مشاهده نمود .(۸)

گاهی در آزمایش‌های یک مرحله‌ای با فرمت ساندویچی که در نمونه مقدار بسیار زیادی آنالیت وجود داشته باشد می‌توان جواب‌های منفی مشاهده نمود که به این پدیده اثر هوک اطلاق می‌گردد. اثر هوک (hook effect)

عبارت از کسب نتایج منفی کاذب در غلظت بالای آنالیت است، در واکنش‌های ایمونولوژی اتفاق افتاده و معادل پدیده پروزون در واکنش‌های سرولوژی است. در این پدیده غلظت آنالیت که می‌تواند آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی باشد، از بالاترین استاندارد نیز بسیار بالاتر بوده و لذا علیرغم زیاد بودن آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مورد آزمایش در سرم، نتیجه منفی کاذب حاصل می‌گردد.

به‌دلیل نتایج منحرف‌کننده و نامطلوبی که اثر هوک می‌تواند بر آزمون‌های ایمنی سنجی باقی گذارد، تحقیقات زیادی در زمینه شناخت این پدیده و چگونگی خنثی‌سازی آن انجام شده است که یکی از آنها با توجه به اینکه پدیده هوک در روش EIA بدلیل تک‌مرحله‌ای و مستقیم بودن روش آزمایش، شایع‌تر از روش IEMA است؛ عدم استفاده از این‌چنین کیت‌هایی است. در شرایطی که ناچار به استفاده از چنین کیت‌هایی باشیم، برای اطمینان از صحت نتیجه، اول از کیت‌هایی استفاده شود که محدوده شروع پدیده هوک در آن قید شده باشد و ثانیاً بایستی هر جواب منفی را با رقت‌های بالاتری از همان سرم تکرار نمود.

البته باید توجه داشت که اگرچه پدیده هوک غالباً در اثر فزونی آنالیت اتفاق می‌افتد، ولی تحقیقات انجام‌شده توسط محققان ثابت نموده که منحصراً بالا بودن میزان آنالیت تنها عاملی نیست که در بروز این پدیده دخالت داشته و لذا عوامل دیگری نیز نظیر توزیع و پراکندگی اپی‌توپ‌ها، وجود اپی‌توپ‌های مشابه و یا استفاده از دو آنتی‌بادی مونوکلونال که بر ضد دو اپی‌توپ مختلف تهیه شده‌اند، می‌تواند در بروز پدیده هوک مؤثر باشد که نمونه آن نیز ایجاد پدیده هوک در روش‌های IEMA علیرغم دومرحله‌ای بودن آنها است که علت آن در نتیجه استفاده از دو آنتی‌بادی مونوکلونال بر ضد دو اپی‌توپ مختلف است .(۹)

مکانیسم این اثر به این شکل است که در آزمایش‌های ساندویچی یک مرحله‌ای، با افزودن نمونه و آنتی‌بادی نشان‌دارشده به‌صورت همزمان بدلیل وجود مقدار بسیار زیاد آنالیت، هردو آنتی‌بادی (آنتی‌بادی نشان‌دار در محلول و آنتی‌بادی موجود در کف چاهک‌ها) توسط مولکول‌های آنالیت اشغال می‌گردند و امکان ایجاد پل رابط مابین آنتی‌بادی موجود در کف چاهک و آنتی‌بادی نشان‌دار در محلول از بین می‌رود. حاصل این مسئله مشاهده نتایج منفی کاذب در آزمایش‌ها است و بهترین مثال عملی آن را نیز می‌توان در خانم‌های باردار دارای مقدار زیاد هورمون HCG دید.(۱۰)

در این گروه از افراد چنانچه آزمایش‌ها به‌صورت یک مرحله‌ای یعنی افزودن همزمان نمونه بیمار با کنژوگه صورت گیرد، احتمال مشاهده نتایج منفی کاذب وجود دارد. برای رفع این مشکل نیز می‌توان با رقیق کردن نمونه مورد آزمایش و یا با دو مرحله‌ای کردن آزمایش‌ها تأثیر اثر هوک را از بین برد.

حساسیت (SENSITIVY)

حساسیت بنا به تعریف به کمترین مقدار آنالیت که از صفر قابل تفکیک باشد اطلاق می‌گردد. حساسیت به دو گروه آنالیتی و عملکردی تقسیم‌بندی می‌شود.

حساسیت آنالیتی ( Analytical sensitivity)

در این نوع حساسیت که اکثر سازندگان کیت‌ها از آن استفاده می‌کنند ۲۰ بار استاندارد صفر را مورد آزمایش قرار می‌دهند و ۲ انحراف استاندارد بالاتر (در تست‌های ایمونومتریک) و یا پایین‌تر (در تست‌های رقابتی) را محاسبه می‌نمایند .جهت مشاهده این نتیجه می‌بایست حتماً به بروشور کیت مراجعه نمایید و چنانچه حساسیت یک کیت به‌طور مثال ۰٫۲ IU/ml ذکر گردیده بود، گزارش‌های نتیجه کمتر از این حد خطا است.

حساسیت عملکردی (Functional sensitivity)

این نوع حساسیت منطبق بر میزان دقت در نمونه‌هایی با مقادیر بسیار پایین است. در این روش با رقیق نمودن نمونه یا سرم دارای مقدار پایین آنالیت و رسم منحنی precision profile برای آن غلظتی که در آن میزان دقت، حداکثر به ضریب (% Cv ۲۰ درصد) رسیده باشد، به‌عنوان حساسیت تلقی می‌گردد. جهت تعیین این نوع حساسیت می‌بایست نمونه سرم با غلظت پایین آنالیت را انتخاب نمود و از آن رقت‌های مختلف تهیه کرد و بر روی هر رقت چندین بار آزمایش انجام داد و ضریب تغییرات cv% را محاسبه نمود. کمترین مقداری از آنالیت که در آن ضریب تغییرات به کمتر از ۲۰ درصد رسیده باشد به‌عنوان حساسیت عملکردی تلقی می‌گردد.