مقدمه: ماست از نظر ساختاری یک ژل پروتئینی شیری است و چنانچه می‌دانیم پروتئین‌های تشکیل دهنده شیر گاو، به ترتیب فراوانی، کازئین‌ها و پروتئین‌های سرمی هستند. پروتئین‌های کازئینی شیر به شکل میسلی و به حالت سیستم کلوئیدی و پروتئین های سرمی به حالت محلول در شیر وجود دارند.
با یک نگاه ساده، از ملزومات ابتدایی برای تشکیل شبکه ژلی ماست، نزدیک شدن پروتئین‌های شیری به یکدیگر است بطوری که بتوانند مرحله به مرحله امکان برقراری اتصال به یکدیگر را، به ترتیب، برای تشکیل تجمعات پروتئینی کوچک، تجمعات پروتئینی بزرگ و شبکه ژلی داشته باشند.
در فرایند تولید ماست، این شرایط مهم به ترتیب و گام به گام در مراحل تیمار حرارتی شیر و سپس تخمیر آن با مایه ماست (استارترکالچر)، فراهم شده و نهایتا شبکه ژلی ماست شکل می‌گیرد.
در این فایل بطور جداگانه ای اثر مراحل "تیمار حرارتی" و "تخمیر" را در مکانیسم تشکیل ژل ماست بررسی می‌کنیم.
1. نقش مرحله تیمار حرارتی شیر در مکانیسم تشکیل ژل ماست
دناتوراسیون پروتئین‌های سرمی و متعاقبا تشکیل تجمعات یا کمپلکس‌های پروتئینی ناشی از آن، یکی از اهداف مهم انجام مرحله تیمار حرارتی شیر اولیه در تشکیل ژل ماست است. چراکه این موارد در ویژگی‌های کیفی، رئولوژیکی و ریزساختاری محصول نهایی نقش به‌سزایی دارند.
1-1- نگاهی به چگونگی دناتوراسیون پروتئین های سرمی
دناتوراسیون پروتئین‌های سرمی شیر را در دو نوع برگشت پذیر و برگشت ناپذیر می‌توان تعریف نمود.
- دناتوراسیون برگشت‌پذیر: تغییرات اندکی در ساختمان مارپیچ پروتئین‌های سرمی اتفاق می‌افتد که به موجب آن بازشدگی جزئی و ناچیز در آنها صورت می‌گیرد.
- دناتوراسیون برگشت‌ناپذیر: تغییرات و بازشدگی ساختمان پروتئینی به حدی زیاد است که پروتئین را مستعد برقراری پیوندها و اتصالات جدیدی می‌کند و این موضوع زمینه ساز تشکیل تجمعات پروتئینی مهم ناشی از آنها می‌شود.
1-1- تجمعات و کمپلکس‌های پروتئینی
تجمعات و کمپلکس‌های پروتئینیِ مربوط به دناتوراسیون برگشت ناپذیرِ پروتئین‌های سرمی، دو دسته اند:
- تجمعات کوچک پروتئینی
- تجمعات بزرگ پروتئینی
تجمعات کوچک پروتئینی ناشی از وقوع واکنش‌های شیمیایی و تشکیل اتصالات دی‌سولفیدی (کووالانسی) بین پروتئین‌هاست.
تجمعات بزرگ پروتئینی ناشی از وقوع واکنش‌های فیزیکی و تشکیل برهمکنش‌های هیدروفوب و نیروهای الکترواستاتیکی (غیرکووالانسی) بین پروتئین‌هاست.
گفتنی‌ست که تشکیل تجمعات پروتئینی مذکور (چه از نوع کوچک و چه از نوع بزرگ) بستگی به دما، پی‌اچ و قدرت یونی سیستم دارند.
تجمعات کوچک پروتئینی در دماهای بالا (بالای 85 درجه سانتیگراد)، پی اچ بالا (بالای 6) و قدرت یونی پایین (M NaCl 1/0› (و تجمعات بزرگ پروتئینی در دماهای کمتر، پی اچ پایین‌تر و قدرت یونی بالا شکل می‌گیرند.
با توضیحات مطرح شده مشخصا در مرحله تیمار حرارتی که به روی شیر ماست زنی انجام می‌شود، دناتوراسیون برگشت ناپذیرِ پروتئین‌های سرمی و متعاقبا تشکیل تجمعات و کمپلکس‌های پروتئینی کوچکِ ناشی از آن صورت می‌گیرد که در این بخش به‌طور خلاصه‌ای به آن اشاره می‌شود.
1-2- تغییرات پروتئین‌های سرمی در تیمار حرارتی شیر:
پروفیل دما – زمان معمول که برای انجام مرحله تیمار حرارتی شیر ماست زنی اعمال می‌شود، در سیستم‌های Batch و Continuous به ترتیب 85 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه و 95-90 درجه سانتیگراد به مدت 5 تا 10 دقیقه است که در آن حدود 85 درصد از پروتئین‌های سرمی شیر دناتوره می‌شوند.
بتالاکتوگلوبولین که دناتوراسیون حرارتی آن از 65 درجه سانتی گراد شروع شده و در 80-75 درجه سانتی گراد به حداکثر مقدار خود می‌رسد، به دو دلیل زیر، پایه‌ی اولیه و اصلی در تشکیل تجمعات و کمپلکس‌های پروتئینی است:
الف: غالب بودن این پروتئین از نظر مقدار و فراوانی نسبت به سایر پروتئین های سرمی شیرگاو
ب: دارا بودن یک گروه تیول (-SH) آزاد در ساختمانش
در اثر تیمار حرارتی اعمال شده، بتا لاکتوگلوبولین از حالت دیمری طبیعی خود به شکل منومری اش درآمده و با در معرض قرارگیری گروه تیول آزادش، مقدمات حمله آن به پروتئین‌های حاوی گروه دی سولفیدی یا دارای سیستیئن فراهم شده و متعاقبا کمپلکس‌های کوچک پروتئینی با آنها تشکیل می‌شود.
به این ترتیب کمپلکس‌های پروتئینی تشکیل شده در این خصوص، که از دسته تجمعات کوچک پروتئینی و بر پایه واکنش‌های تبدیلی تیول- دی سولفیدی هستند، در انواع زیر تشکیل خواهند شد:
الف: کمپلکس‌های "سرمی – سرمی" عمدتا ناشی از اتصال:
بتالاکتوگلوبولین – بتالاکتوگلوبولین
بتالاکتوگلوبولین – آلفالاکتالبومین
بتالاکتوگلوبولین – آلبومین سرم گاوی
ب: کمپلکس‌های "سرمی – کازئینی" عمدتا ناشی از اتصال:
بتالاکتوگلوبولین – کاپاکازئین
آلفالاکتالبومبن – کاپاکازئین
(بتالاکتوگلوبولین – آلفالاکتالبومین) – کاپاکازئین
نکته: پروتئین کازئین آلفا اس دو نیز با داشتن دو پیوند دی‌سولفیدی در ساختمانش، مستعد شرکت در تشکیل این نوع کمپلکس هاست! ولی از آنجایی که آلفا اس دو کازئین در حالت عادی و طبیعی در هسته‌ی هیدروفوب میسل کازئینی قرار داشته و در این شرایط دسترسی به آن برای تشکیل کمپلکس مذکور وجود ندارد، پس اهمیتی در این مورد نخواهد داشت.
نهایتا در مرحله تیمار حرارتی، مهمترین کمپلکس‌های پروتئینی در فاز سرمی ( کمپلکس‌های سرمی – سرمی) و در سطح میسل های کازئینی (کمپکس های سرمی – کازئینی) تشکیل می‌گردند که زمینه ساز تشکیل تجمعات پروتئینی بزرگ (در شرایط حاکم بر مرحله تخمیر شیر) خواهند بود. تجمعات پروتئینی بزرگی که بر پایه تعاملات هیدروفوبیکی و الکترواستاتیکی بین پروتئین‌های شیری شکل گرفته و سازنده ساختار ژل ماست خواهند بود.
2. نقش مرحله تخمیر شیر بر مکانیسم تشکیل ژل ماست
کاهش پی‌اچ ساده‌ترین و مهمترین تغییری است که با شروع فعالیت میکروب‌های مایه ماست در شیر مایه خورده‌ی گرمخانه‌گذاری شده گزارش می‌شود. طبیعتا این افزایش اسیدیته، روندی آرام داشته و متناسب با فعالیت میکروب‌های مایه ماست و تولید اسید لاکتیک توسط آنهاست. بررسی ساده‌ی اثر افت پی‌اچ بر پروتئین‌های شیر بیانگر نقش مرحله تخمیر بر چگونگی تشکیل ژل ماست خواهد بود که در این قسمت این تغییرات پروتئینی را مرحله به مرحله، همگام با کاهش پی‌اچ در محدوده 7/6 (پی اچ اولیه شیر) تا 6/4 (پی اچ ایزوالکتریک کازئین) دنبال می‌کنیم.
وقایع ناشی از افت پی‌اچ در شیر از سه جنبه به روی پروتئین‌های شیری قابل بحث است:
1- کاهش بار الکتریکی منفی پروتئین‌ها که موجب کاهش نیروی دافعه الکترواستاتیکی یا دافعه استریک بین آنها می‌شود.
2- انعقاد پروتئین‌ها در پی‌اچ ایزوالکتریک‌شان (که در راستا و ادامه مورد اول اتفاق می‌افتد)
3- تبدیل کلسیم از حالت کلوئیدی به محلول که می‌تواند موجبات سست شدن و نهایتا از هم پاشیدن میسل کازئینی را فراهم آورد.
اصولا پروتئین‌ها در بالای نقطه ایزوالکتریک‌شان دارای بار منفی، در نقطه ایزوالکتریک شان بدون بار و در زیر نقطه ایزوالکتریک شان دارای بار مثبت هستند. پس طبیعی است که با افت پی‌اچ شیر، بار منفی پروتئین‌ها و نتیجتا نیروی دافعه بین آنها کم شده و ادامه این روند موجبات نزدیکی آنها به یکدیگر را فراهم آورد. این نزدیک شدن گام اولیه برای برقراری ارتباط و اتصال بین آنهاست.
پروتئین‌های کازئینی در ساختار میسلی به شکل ذراتی کلوئیدی در شیر پراکنده‌اند. یکی از عوامل مهم در ثبات حالت کلوئیدی میسل های کازئینی بار الکتریکی منفی سطح میسل‌های کازئینی است. افت پی‌اچ، چنانچه به آن اشاره شد، با کاهش بار منفی سطح میسل‌ها، تدریجا ناپایداری سیستم کلوئیدی کازئینی را زمینه‌سازی می‌کند. از سوی دیگر کاهش پی اچ، کلسیم کلوئیدی ساختار میسلی را به حالت محلول درآورده و به این شکل موجب خروج آن از ساختار میسلی می‌شود. کلسیم کلوئیدی مذکور عمدتا در ترکیب نانوخوشه‌های کلسیم فسفات کلوئیدی است که عاملی مهم در اتصال ساب میسل‌های کازئینی به هم هستند. پس با خروج آنها از ساختمان میسل، ساختار داخلی میسل رفته رفته سست تر شده و در معرض از هم پاشیدگی قرار می‌گیرد.
نتایج تحقیقات صورت گرفته در این زمینه نشان داده که در پی‌اچ 7/5، حدود نیمی از کلسیم فسفات کلوئیدی ساختمان میسل را ترک کرده و با رسیدن پی‌اچ تقریبی 5، مسیل بطور کامل از نظر کلسیم فسفات کلوئیدی دمینراله می‌شود. این موضوع نه تنها به وضوح به از هم پاشیدگی میسل اشاره می کند که حتی بیانگر سه مورد مهم زیر نیز می‌باشد:
(1) قدرت یونی سیستم به واسطه افزایش کلسیم یونی افزایش می‌یابد.
(2) کازئین‌های هیدروفوبی که به حالت طبیعی در بخش داخلی میسل قرار داشتند با از هم پاشیدن میسل از ساختار منظم میسلی خارج شده و با نزدیک‌تر شدن‌شان بهم (که بواسطه کاهش بار الکتریکی‌شان ناشی از کاهش همزمان پی اچ اتفاق می افتد) امکان برقراری اتصالات فی‌مابین جدید و با آرایش متفاوت برایشان فراهم می‌شود.
(3) نکته قابل توجه نیز اینجاست که در پی‌اچ تقریبی 2/5، پروتئین‌های موجود در شیر به قدر کافی برای امکان اتصال فی‌مابین شان به یکدیگر نزدیک شده‌اند.
با در نظر گرفتن موارد فوق و مرور مطالب مطرح شده در خصوص "تجمعات پروتئینی" می‌توان به روشنی دریافت که شرایط حاضر در مرحله تخمیر (از نظر دما، پی اچ و قدرت یونی) برای تشکیل تجمعات و کمپلکس‌های بزرگ پروتئینی کاملا مهیاست. از اینرو تجمعات بزرگ پروتئینی بواسطه برهمکنش‌های هیدروفوب[1] و تعاملات الکترواستاتیکی[2]شروع به شکل‌گیری می‌کنند. حتی کمپلکس‌های کوچک پروتئینی که در مرحله تیمار حرارتی شکل گرفته بودند نیز از بخش‌های هیدروفوب و باردار خود به یکدیگر نزدیک شده و در تشکیل این تجمعات بزرگ‌تر شرکت می‌نمایند.
نکته قابل توجه دیگری که در مکانیسم تشکیل ژل ماست اهمیت دارد، تثبیت این شبکه ژلی در گذر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین‌های تشکیل دهنده آن است.
در این میان، پی‌اچ ایزوالکتریک کازئین (به‌عنوان پروتئین اصلی) و پی‌اچ ایزوالکتریک بتالاکتوگلوبولین (به‌عنوان فراوان‌ترین و مهمترین پروتئین سرمی شیر گاو) اهمیت ویژه‌ای دارند.
پی اچ ایزوالکتریک بتالاکتوگلوبولین حدود 1/5 است که به دامنه انتهایی نقطه ایزوالکتریک بتاکازئین، (یکی از مهمترین کازئین های اصلی شیر از نظر فراوانی و درجه هیدروفوبیسیتی) بسیار نزدیک است. پس می‌توان نتیجه گرفت که در پی اچ حدود 1/5 یا 2/5 قسمت مهمی از شبکه ژلی ماست در حال تثبیت شدن است این در حالی است که همچنان با کاهش بیشتر پی‌اچ که در طی گرمخانه گذاری اتفاق می‌افتد، بار الکتریکی سایر پروتئین‌های شیری بیشتر کاهش یافته، نزدیکی‌شان به هم بیشتر شده و اتصالات و پیوندهای پروتئینی – پروتئینی جدیدتر و بیشتری شکل می‌گیرند و به این ترتیب ساختمان شبکه ژلی ماست کامل‌تر و مستحکم‌تر می‌شود تا نهایتا در پی‌اچ ایزوالکتریک کازئین (6/4) این شبکه کاملا تثبیت شده و به شکل نهایی خود در مرحله تخمیر می‌رسد و این همان پی اچ ای است که از نظر تئوری بیانگر زمان خاتمه مرحله گرمخانه گذاری ماست است.
[1] - برهمکنش های هیدروفوب در محل نزدیکی بخش های هیدروفوب پروتئین ها به یکدیگر تشکیل می گردد.
[2] - تعاملات الکترواستاتیکی عمدتا میان بخش های باردار و قطبیِ پروتئین ها برقرار می شود.
