گزارش کار آزمایشگاه درس روش های نوین آزمایشگاهی در مقطع کارشناسی ارشد
در این گزارش کار به بررسی دستگاه های اسپکتروفتومتر UV Visible ، دستگاه اسپکتروفتومتر مادون قرمز ، دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (AAS) و دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC) می پردازیم که در آزمایشگاه های صنایع غذایی، دارویی و زیست شناسی کاربرد های زیادی دارد.
این گزارش کار آزمایشگاه رو خودم برای درس روش های نوین آزمایشگاهی در دانشگاه تهران شمال نوشته ام و دوست داشتم این مطالب رو به اشتراک بگذارم تا دانشجویان دیگر هم بتوانند از آن استفاده کنند.
هدف آزمایش:
آشنایی با دستگاه اسپکتروفتومتر UV Visible
اساس کار دستگاه سپکتروفتومتر UV Visible :
اسپکتروفتومتر براساس جذب نور کار می‌کند. با استفاده از میزان نور جذب شده در طول‌موج‌های خاص می‌توان اطلاعات ارزشمندی از نمونه را به دست آورد . از آن جایی که هر ماده جذب مخصوص به خود را دارد، یک رابطه منحصر به فردی بین ماده و طیف UV-VIS وجود دارد. بنابراین از این طیف می‌توان اطلاعات کمی ماده را به دست آورد. در واقع می‌توان با اندازه‌گیری میزان جذب در یک طول موج خاص، غلظت آنالیت را تعیین کرد.
در این روش طیف سنجی، نور با مولکول‌‌های نمونه وارد برهمکنش می‌شود. در طی این فرآیند برخی از طول موج‌های نور جذب ماده می‌شوند و برخی دیگر بدون تغییر از ماده عبور می‌کنند. اسپکتروفتومتر نتایج حاصل از این اندازه‌گیری را به صورت نمودار در صفحه نمایشگر نشان می‌دهد. در این نمودار محور عمودی جذب (عبور) و محور افقی طول موج را نشان می‌دهد.
اجزای دستگاه اسپکتروفتومتری
مراحل کلی استفاده از اسپکترو فتومتر:
1. بدست آوردن غلظت استاندارد ها
2. آماده کردن محلول بالنک و محلولهای استاندارد
3. تشکیل معادله ی خط (با ترسیم نمودار غلظت ، جذب نور)
4. استفاده از دستگاه برای بدست آوردن غلظت محلولهای مورد نظر
برای استفاده از نور مرئی دستگاه از سل های پلاستیکی و شیشه ای استفاده می کنیم و برای استفاده از نور UV از سل های کوارتزی استفاده می کنیم.
سل ها حتما باید کاملا تمیز باشد و هیچگونه ناخالصی و آلودگی روی آنها نباشد.
نحوه ی قرار گیری سل در دستگاه به این صورت است که قسمت شفاف سل در سمت نور قرار می گیرد و قسمت کدر سل در سمت دیگر (خودمان) قرار می گیرد.
دستگاه را با حلال (در این آزمایش آب مقطر است) صفر می کنیم.
دستگاه اسپکتروفتومتری مورد استفاده در آزمایشگاه دو پرتویی بوده است. بنا بر این هر دو سل را از حلال پر کرده و داخل دستگاه قرار می دهیم، سپس نرم افزار دستگاه را رو باز را باز کرده و در قسمت ستاپ که به شکل پیش فرض روی 200 تا 800 نانومتر قرار دارد اما می توان آن را تغییر داد، اسکن را شروع می کنیم. نمودار آب مقطر به شکل یک خط صاف رسم می شود.
حالا نمونه را داخل جایگاه جلویی در دستگاه قرار می دهیم و می گذاریم قسمت عقبی سل شاهد باقی بماند. دکمه ی استارت را می زنیم و در نرم افزار اسم نمونه را انتخاب می کنیم. حال دستگاه بین 200 تا 800 نانومتر گراف را رسم می کند و ما نتتظر می مانیم تا پیک ها را در گراف بینیم. در نقاط پیک روی گراف، جذب توسط نمونه صورت گرفته.
با شنیدن صدای تَق در دستگاه متوجه می شویم که دستگاه از روی لامپ نتگستن به لامپ دوتریوم سوییچ می شود و از روی ناحیه مر ئی به ناحیه uvمنطقل می شود.
ما در ناحیه های 272 / 222/ 220 / 206 یکسری جذب داریم. ما معمولا بیشترین جذب که نقطه ی ماکس می نامیم در نظر می گیریم. در ناحیه 222 بیشترین جذب صورت گرفته ( 142/4 ). به این نقطه لاندا ماکس می گویند.
* بهترین ناحیه جذب، جذب زیر 1 است.
* محلول های خیلی غلیظ از رابطه ی بیرلامبرت پیروی نمی کنند و باید آن را رقیق کنیم تا جذب درست داشته باشند.
با تهیه نمونه هایی که غلظت آن ها را می دانیم و قرار دادن آن ها در دستگاه و اندازه گیری میزان جذب و رسم نمودار آن می توانیم غلظت محلول مجهول را پیدا کنیم.
از قابلیت های دیگر دستگاه اسپکتروفتومتری می توان گفت این دستگاه میتواند میزان جذب در تک تک طول موج ها را به صورت یک جدول اکسل خروجی به ما بدهد.
هدف آزمایش:
آشنایی با دستگاه اسپکتروفتومتر مادون قرمز
اساس کار دستگاه سپکتروفتومتر مادون قرمز:
اسپکتروفتومتر مادون قرمز ، همچنین به عنوان اسپکتروفتومتری IR شناخته می شود ، می تواند ساختار ترکیبات شیمیایی پیوند کوالانسی مانند ترکیبات آلی را نشان دهد.
هنگامی که “نور” یا اشعه مادون قرمز به یک مولکول برخورد می کند ، پیوندهای موجود در مولکول انرژی مادون قرمز را جذب می کنند و با لرزش پاسخ می دهند.وقتی نور به نمونه برخورد می کند، آنالیت مقداری را جزب کرده و باقی عبور کرده و به دتکتور می رسد.
ما دو نوع طیف در این دستگاه داریم:
طیف نشری
طیف جذبی
که به کمک آن ها می توانیم گروه های عاملی، ساختار مولکولی و ترکیب مواد را مشخص کرد. در صنایع غذایی و دارویی از این دستگاه استفاده می شود.
به طور کلی در این دستگاه، یک نمونه جامد را با ماده ای مانند پتاسیم بروماید (که به عنوان یک ترکیب یونی ، در اسپکتروفتومتر مادون قرمز نشان نمی دهد) آسیاب می کند و آن را در یک دستگاه خاص قرار می دهد تا اجازه دهد حسگر از طریق آن بدرخشد.
گاهی اوقات نمونه های جامد را با حلالهایی مانند روغن معدنی مخلوط می کند (که در طیفIR یک محدودیت شناخته شده است) و از روش نمونه گذاری مایع استفاده می کند، که شامل قرار دادن یک نمونه بین دو صفحه نمک فشرده کلرید سدیم است تا اجازه دهد، نور مادون قرمز برای تابش از طریق آن عبور کند.
اجزای دستگاه اسپکتروفتومتر مادون قرمز:
جایگاه سل در دستگاه بسته به نوع جامد، مایع و گاز بودن متفاوت است.
نمونه ی جامد : مانند پودر های رسوبی
به کمک KBR (برومید پتاسیم) که پودر سفید نگی است، قرص یا دیسک هایی از نمونه تهیه می کنیم به این صورت که در آوَنی از جنس عقیق (که آلودگی را منتقل نکند) به نسبت یک به صد ز نمونه و برومید پتاسیم می ریزیم، ترکیب را هم زده و با هم مخلوط می کنیم.
بعد ار هموژنه شدن کامل پودر ها، آن ها را داخل دایست ریخته و پودر را پرس می کنیم تا تبدیل به قرص شود.
*برومید پتاسیم حتما باید کاملا خشک باشد و رطوبت نداشته باشد تا پیک آب در نمودار ظاهر نشود. برای این امر قبل از استفاده از برومید پتاسیم آن را داخل آون قرار می دهیم تا کاملا خشک شود.
نمونه مایع: دارای دو روش قیمی و جدید است.
در روش قدیمی از سل های نمکی استفاده می کردند. نمونه داخل پنجره های نمکی بین دو سل قرار می گرفت و اندازه گیری انجام می شد.
اما در روش جدید یک قطره از نمونه را روی قرص خالص KVRریخته و آن را داخل دستگاه قرار می دهیم و اندازه گیری انجام می شود.
روش دیگر استفاده از سل های ATR یا انعکاسی یا کریستالی است که نمومه مایع یک لایه نازک به صورت یکنواخت روی کریستال میگیرد. جنس این کریستال از سلنید روی است.
نمونه های پلیمری: مانند نایلون
تغییری روی آنالیت صورت نمیگیرد و روی سل مگنتی قرارش میدهیم.
نمونه گازی: در سل های مخصوصی که دارای شلنگ هستند.
دستگاه اسپکتروفتومتری داده ها را به صورت نمودار در آورده و در اختیار ما قرار می دهد.
هدف آزمایش :
آشنایی با دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (AAS)
اساس کار دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (AAS)
طیف‌سنجی جذب اتمی به عنوان یک روش قوی در تجزیه بر اساس جذب فوتون در طول موج مربوط استوار است. از آنجایی که تحریک غیرفلزات به انرژی بسیار بالایی نیاز دارد این روش عمدتا برای فلزات بکار می رود. این گونه های تجزیه‌ای آسانتر و با تابش در فرکانس های نسبتا پایین ماوراءبنفش یا مرئی تحریک می شوند. در اسپکترومتری جذب اتمی هدف تجزیه کمی و کیفی مقادیر عناصر می باشد.
اسپکترو متری جذب اتمی روشی برای تعیین حضور (آنالیز کیفی) و غلظت (آنالیز کمی) عنصر فلزی خاص در یک نمونه می باشد.
اجزای دستگاه جذب اتمی:
يک منبع نورانی که معمولا لامپی کاتدی و توخالی می باشد که کاتد آن از جنس عنصر نمونه ساخته شده است داخل لامپ از گاز بی اثر آرگون يا نئون در فشار کم پر شده است.
سيستم شعله که نمونه محلول با سرعت يکنواخت به داخل آن تزريق می شود و درجه حرارت به اندازه کافی است تا بتواند بخار اتمی فلزات موجود در محلول را توليد نمايد .عمومی ترين شعله مورد استفاده سيستم هوا – استيلن می باشد.
يک مونوکروماتور که خطوط رزونانس مختلف را از هم جدا می کند وفقط نور يکنواخت عبور می دهد.
يک فتو مولتی پلاير (دستگاه تقويت کننده) که نور را تبديل به انرژی نموده وشدت آنرا تقويت می کند.
در روش کار دستگاه جذب اتمی باید بدانیم که اگر يک محلول شامل ترکيبات فلزی به داخل شعله مانند هوا – استيلن تزريق شود بخار اتمی از فلز تشکيل خواهد شد. طريقه انتشار نور بدين ترتيب است که در لامپ مخصوص، اتم های فلز به يک سطح انرژی بالا رسيده و تشعشعات مخصوص آن فلز را منتشر مي کنند. پس از تزريق نمونه به دستگاه و تبديل شدن يون های فلزی به اتم، اتم ها قادر خواهند بود نور منتشر شده از منبع نور را که از ميان شعله حاوی اتم های عنصر عبور می نمايند جذب نمايند، ميزان جذب متناسب با تراکم اتم ها در شعله می باشد و اتم های يک عنصر بخصوص فقط می توانند تشعشعات طول موج مشخص خودشان را جذب نمايند بنابراين تداخلات طيفی که در روش های دیگر مزاحم می باشند به ندرت اتفاق می افتد.
لامپ کاتدی فلزی را که می خواهيم اندازه گيری کنيم، در دستگاه نصب کرده وطول موج آنرا تنظيم نماييد.
عرض شکاف (ديافراگم) را بر طبق توصيه کارخانه سازنده دستگاه برای عنصری که اندازه گيری می شود تنظيم می کنیم.
دستگاه را روشن نموده و مقدار جريان قرار دادی بوسيله کارخانه سازنده را برای لامپ کاتدی که بکار می بريم برقرار می کنیم.
فرصت می دهيم که دستگاه گرم شده و منبع انرژی ثابت شود سپس شعله پخش کن را نصب کرده و جريان هوا را برقرار می کنیم و ميزان آن را، که توسط کارخانه سازنده جهت بدست دادن ماکزيمم حساسيت برای فلزي که اندازه گيری می شود معين شده است، تنظيم می کنیم.
جريان استيلن را بر قرار نموده و ميزان آن را تا مقدار معين شده تنظيم کرده و شعله را روشن می کنیم. شعله پخش آن را در حالت ايده ال تنظيم کرده و دستگاه آماده برای کار می شود .
اول از طریق آب مقطر دستگاه را کالیبره کردا و سپس نمونه ی اصلی را وارد می کنیم. نمونه از لوله حرکت کرده و داخل شعله اسپری می شود و اتم سازی انجام می شود. ابتدا غلظت نمونه های شاهد را اندازه گیری می کنیم و منحنی نمودار رسم می شود، سپس آنالت را در دستگاه گذاشته و غلظت آن را به شکل نقطه یابی در نمودار نمایش می دهد.
هدف آزمایش:
آشنایی با عملکرد دستگاه کروماتوگرافی گازی
اساس کار دستگاه کروماتوگرافی گازی
کروماتوگرافی براساس پخش انتخابی اجزاء مختلف در بین 2 فاز پایه گذاری شده است. یکی از این فازها، فاز ساکن یک ماده جاذب یا Stationary phase نامیده می‌شود که داراي سـطح زیـادی است و دیگری فاز متحرك یا mobile phase است.
در کروماتوگرافی گازی، فاز متحرک یک گاز است. فاز ساکن یک ماده جامد یا مایع پوشش داده شده و یا دارای پیوند با یک جامد بر روی دیواره ستون است.
گاز حامل نقش مهمی را در کروماتوگرافی گازی ایفا می‌کند. گاز حامل، گازی خشک، بی‌اثر و عاری از اکسیژن است. گاز حامل باید یک گاز بی‌اثر باشد تا با فاز ساکن، حلال و یا نمونه واکنش ندهد، به همین دلیل معمولاَ از نیتروژن یا هلیم استفاده می‌شود گاز حامل باید خلوص بالایی داشته باشد چرا که ناخالصی‌هایی همچون اکسیژن و آب می‌توانند با فاز مایع در ستون واکنش دهند و آن را تخریب کنند.
کروماتوگرافی گازی یکی از رایج‌ترین و مهم‌ترین دستگاه‌های مورد استفاده در آناليز دستگاهی به روش كروماتوگرافی است، که برای جداسازی ترکیباتی با دمای جوش پایین‌تر از 500 درجه سانتیگراد (ترکیبات فرار) به کار می‌رود. در کروماتوگرافی گازی، جداسازی اجزا یک مخلوط بر اساس نقطه جوش ترکیبات و همچنین متناسب با میزان توزیع اجزا تشکیل دهنده مخلوط بین فاز متحرک گازی و فاز ساکن جامد یا مایع صورت میگیرد.
اجزای دستگاه GC :
مراحل کار با دستگاه GC به طور خالصه شامل راه اندازی، کالیبراسیون و تنظیمات دستگاهی، آماده سازی و چگونگی تزريق نمونه، انتخاب روش يونیزاسیون و اسكن، انتخاب و اجرای روش، چگونگی استخراج يك طیف و جستجوی کتابخانه ای و جمع آوری اطالعات است.
قبل از تزريق نمونه، دو سر ستون کروماتوگرافی بايد به انژکتور و طیف سنج جرمی متصل شود و خالء الزم با استفاده از پمپ به وجود آمده باشد. مقدار کمی از نمونه µl 1 از دريچه کوچكی وارد منبع يونش می شود. اجزای موجود درنمونه براسـاس بـرنـامـه دمـايـی دستگاه و برحسب تمايلی که فاز ساکن درون ستون برای نگهداری آنـهـا دارد در اثر گرما و خالء موجود به صورت گاز درآمده، با جريانی از الكترونهای پرانرژی (حدود ev 50-70 ) به طرف آند مقابل شتاب گرفته و جذب آن می شود در نتیجه بمباران الكترونی، جزئی از مولكول های نمونه يونیزه می شود و از يكديگر جدا می شوند.
دستگاه طیف سنج بايد طیف جرمی هر جزء موجود در مخلوط را پیش از خروج جزء بعدی از ستون کروماتوگرافی گازی بدست آورد تا از آلوده شدن يك ماده توسط ماده بعدی قبل از به دست آمدن طیف آن جلوگیری شود. از آنجا که ستون های مويی با توان باال در کروماتوگرافی گازی استفاده می شود، لذا در بیشتر موارد، قبل از آنكه جريان گازی، آنالیز شود، ترکیبات به طور کامل جدا می گردند.
فاز متحرك اجزای جدا شده را به طرف آشكارساز هدايت می کند. جريان گاز خارج شده از GC وارد محفظه يونیزاسیون طیف سنج جرمی می گردد هنگامی که الكترون های پر انرژی به مولكول های نمونه برخورد کند، يونیزاسیون مولكولها رخ می دهد يونهای حاصله، از درون آنالیزر عبور کرده و در نهايت آشكار می گردند. با استفاده از Massحصول طیف جرمی هر جزء موجود در نمونه ممكن می گردد طیف جرمی به صورت نموداری از درصد فراوانی يون بر حسب نسبت e/m شود نشان داده می شود. نگهداری و مراقبت : به صورت دوره ای کالیبره گردد.
مهرنوش عسکری
