اسپکتروفتومتر یکی از کاربردی ترین تجهیزات آزمایشگاهی به شمار می آید. این دستگاه در واقع نوعی طیف سنج می باشد و از آن در انجام بسیاری از پژوهش های علمی استفاده میشود. کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر به صورت تخصصی، در انجام واکنش های رنگ سنجی و اندازه گیری کدورت یا غلظت مایعات می باشد.در اختیار داشتن این دستگاه، برای انجام اکثر آزمایش های زیستی و شیمیایی امری ضروری است، به گونه ای که اندازه گیری بسیاری از پارامترهای آزمایشگاهی بدون وجود آن امکان پذیر نمی باشد.
اهمیت وجود این دستگاه در آزمایشگاه سبب شده، تا خرید اسپکتروفتومتر در اولویت کار اکثر آزمایشگاه ها قرار گیرد. این دستگاه کاربردها و قابلیت های متنوعی دارد به گونه ای که، از اسپکتروفتومتر آزمایشگاهی در اندازه گیری های بسیار حساسی چون؛ تعیین غلظت ژنوم نیز استفاده میشود. از این رو به سبب اهمیت و نقش این دستگاه در پژوهش تحقیقاتی و علمی، در ادامه با ساختار دستگاه اسپکتروفتومتر و نحوه ی عملکرد آن آشنا خواهیم شد.
اسپکتروفتومتر در واقع میزان نور عبوری از نمونه را به شکل تابعی از طول موج می سنجد. به عبارت دیگر ساز و کار این دستگاه به گونه ای است که، برهمکنش میان نور با ماده را مورد سنجش قرار می دهد. این دستگاهاز دو منبع نور برای انجام رنگ سنجی بهره می برد. این دو منبع شامل؛ لامپ دوتریم جهت تامین نور فرابنفش و لامپ هالوژنی تنگستن، جهت تامین گستره ی نور ی مرئی می باشند. در حقیقت این دستگاه به منظور انجام روش اسپکتروفتومتری برای مایعات تعبیه شده است اما، قابلیت سنجش و بررسی گازها و مواد جامد شفاف را نیز دارا می باشد.
اسپکتروفتومتر آزمایشگاهی در محدوده ی طول موج ۱۹۰ تا ۱۱۰۰ نانومتر کار میکند. همچنین این دستگاه قادر به اندازه گیری طول موج های تکی و طیف های روبشی نیز می باشد. دقت اندازه گیری بالای این دستگاه سبب شده تا بتواند، حتی مقادیر و غلظت های بسیار اندک را نیز اندازه گیری کند. از این رو میتوان، یکی از با اهمیت ترین موارد کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر را در اندازه گیری غلظت مولکولهایی چون؛RNA و DNA دانست. از این روست که این دستگاه نه تنها در آزمایشگاهای شیمی بلکه، در آزمایشگاه های زیست شناسی و ژنتیک نیز یافت میشود.
اساس کار دستگاه اسپکتروفتومتر به این صورت است که، امواج الکترومغناطیس تولید شده توسط دستگاه به نمونه تابیده شده و توسط آن جذب میشود. شدت جذب این امواج توسط ماده، غلظت آن را تعیین خواهد کرد. در واقع این دستگاه، با اندازه گیری میزان نور عبوری از یک آنالیت که دارای طول موج مشخصی نیز می باشد، غلظت نمونه را اندازه گیری می کند. بر طبق قانون بیر – لامبرت در روش اسپکتروفتومتری، میزان نوری که در یک طول موج معین توسط یک نمونه ی مایع جذب میشود، با غلظت آن ماده تناسب و ارتباط دارد.
در حقیقت این امر از آن جهت رخ می دهد که، مواد به دلیل تفاوت در آرایش و تعداد اتمها، مولکولها و نیز گروههای عاملی، نورهایی با طول موج متفاوت و به خصوص را جذب میکنند. به منظور انجام روشهای رنگ سنجی، نمونه ی محلول در ظرف شیشه ای شفافی بنام کووت که از جنس کوارتز است ریخته و در محفظه دستگاهقرار داده میشود. با روشن شدن دستگاه، نور به نمونه ی موجود در این ظرف تابیده شده و غلظت نمونه مشخص خواهد شد.
اسپکتروفتومتر در دو نوع معمولی و آرایه دیودی طراحی و تولید میشود. هر یک از این دو مدل، ساز و کاز خاص خود را دارند که در ادامه به شرح آن خواهیم پرداخت.
در دستگاه اسپکتروفتومتر معمولی،نور چند رنگ از درون یک شکاف ورودی عبور کرده و به باریکه ای از نور تبدیل میشود. نور پس از عبور از یک منشور، به دسته های نوری با طول موجهای متفاوت تقسیم میشود. بسته به نوع شکاف خروجی نور، نوری تک رنگ با طول موج مشخص، از این شکاف عبور کرده و به نمونه تابیده میشود. در نهایت نور عبوری از نمونه به یک آشکارساز رسیده و شدت آن سنجیده خواهد شد. کاربرد دستگاه اسپکتروفتومتر معمولی، بیشتر در سنجش مقدار جذب در یک نقطه ی خاص از طیفی مشخص است. اگر نیاز به اندازه گیری میزان جذب نور در طول موجهای مختلف دارید، این مدل به جهت عدم تنظیم مکرر زاویه ی مونوکروماتور، برای کار شما مناسب نمی باشد و باید از نوع دیگری از این دستگاه استفاده نمایید.
در این مدل نور پلی کروماتیک تولید شده توسط منبع نور به نمونه تابیده و از آن عبور میکند، سپس به سمت شکاف ورودی متمایل میشود. در این زمان پلی کروماتور، نوری که از نمونه عبور میکند را بر روی دیود پراکنده خواهد کرد. پلی کروماتور از یک شکاف ورودی و یک بخش پخش کننده ی نور تشکیل شده است. هر یک از دیودها تنها باند بسیار باریکی از طیف نوری را اندازه گیری میکنند.
هر دو مدل اسپکتروفتومتر آزمایشگاهی، به صورت تک پرتو طراحی و تولید میشوند. مطالعات نشان می دهد، از آنجایی که طیف ها در نمونه ی آرایه دیودی سریعتر مشخص میشوند و مدت زمان جا به جایی رفرنس و نمونه حداقل است، جهت طراحی به صورت تک پرتو مناسب تر هستند. در سیستم دو پرتو، نور در ابتدا به یک مونوکروماتور وارد و سپس به یک چاپر هدایت میشود. در این مرحله، چاپر نور را با سرعت زیاد میان رفرنس و نمونه جا به جا کرده و چندین بار در ثانیه، میزان آن را اندازه گیری خواهد کرد.
اجزای دستگاه اسپکتروفتومتر هر یک نقش و عملکرد ویژه ای در انجام روش اسپکتروفتومتری بر عهده دارند، که در ادامه با آنها آشنا خواهیم شد.
منبع در ساختار دستگاه اسپکتروفتومتر جزئی است که انرژی تابشی مورد نیاز دستگاه را تولید میکند. انرژی تابشی به شکل نوری با طول موجهای مختلف به نمونه تابیده میشود. منبع نور در این دستگاه، معمولاً لامپ های هالوژنی تنگستن یا لامپ های UV می باشند. از نور تولید شده توسط این لامپ ها، جهت اندازه گیری میزان جذب نور در طول موج نور مرئی و فرابنفش استفاده میشود. از آنجایی که باید شدت نور خروجی از منبع مقدار ثابتی باشد، نباید ولتاژ برق ورودی به دستگاه نوسان داشته باشد. از این رو معمولاً از یک تنظیم کننده ی ولتاژ در ساختار دستگاه استفاده میشود.
در ساختار اسپکتروفتومتر، محلی برای قرار دادن نمونه ی مورد آزمایش تعبیه شده است. این محفظه در مدلهای مختلف این دستگاه، شکلهای متنوعی دارد. به عنوان نمونه برخی از آنها جهت قرار دادن لوله ی آزمایش، میکروسل، یا میکروپلیت طراحی شده اند. همچنین شکل مرسوم اکثر این محفظه ها به گونه ای است، که جهت قرار گیری کووت که فرم مکعب مستطیل دارد مناسب می باشد. هر کووت قطر مشخصی داشته و با توجه به جنسی که دارد، جهت اندازه گیری در طول موج مشخصی مورد استفاده قرار می گیرد.
این جز از دستگاه اسپکتروفتومتر وظیفه ی آن را دارد که، نور تولید شده توسط منبع نور را به صورت پرتوهای تک رنگ تبدیل کند. مونوکروماتورها در واقع شیشه هایی رنگی می باشند که بخش زیادی از پرتوهای ورودی به شکاف را جذب و تنها نورهایی با طول موج مشخص را از خود عبور می دهند. این عمل عمدتاً توسط سیستم گریتینگ یا منشور انجام میشود. منشورهای مورد استفاده در این سیستم، شکلی هرمی و لبه هایی تیز دارند. نور با توجه به ضریب شکست منشور، به چندین پرتو تجزیه خواهد شد. گریتینگ نوعی صفحه ی صیقلی شکل است که، شکاف هایی موازی و با فواصل نزدیک به هم دارد و در این سیستم، طیفی خطی یا موازی ایجاد میکند.
آشکارساز در ساختار اسپکتروفتومتر، وظیفه ی تبدیل نور به انرژی الکتریکی را بر عهده دارد. تبدیل با توجه به شدت و میزان نور تابیده شده به سطح مونوکروماتور صورت می پذیرد. آشکارسازها در واقع مجموعه ای از فتوسل های ساخته شده از مواد حساس به نور می باشند.
نمایشگر در واقع خارجی ترین بخش یک اسپکتروفتومتر آزمایشگاهی می باشد. این جز در واقع میزان انرژی الکتریکی دریافتی از آشکارساز را تفسیر و به شکل داده هایی قابل درک نمایش می دهد. نمایشگر معمولاً داده ها را به صورت اعداد یا نمودارهایی که نشانگر شدت جذب نور هستند، نشان می دهد.
